Rekombinantne DNA (deoksüribonukleiinhape) on sünteetiline nukleiinhappe tüüp, mis on loodud DNA sidumisel järjestused koos, mida normaalsetes oludes ja keskkonnatingimustes loomulikult ei eksisteeriks tingimused.
Rekombinantse DNA valmistamise protsess viiakse tavaliselt läbi rekombinantse plasmiidiga. Täpsemalt, see on tehtud arenenud DNA-tehnoloogia protseduuri abil bioloogias ja geneetikas, mida nimetatakse geenide kloonimiseks. Rekombinantne DNA viiakse rakku, mis seejärel toodab täiesti uut valku, ja seda kasutatakse ravimite, antikehade või spetsiifiliste valkude sünteesimiseks ainult uurimiseks.
Rekombinantse DNA tehnoloogia tutvustus
Doonororganismi või bioloogilise allika DNA ekstraheeritakse kõigepealt rakkudest ja seejärel viiakse läbi lõikamisprotsess, mida nimetatakse ensümaatiliseks restriktsiooniks. See tekitab DNA fragmendid, mis sisaldavad huvipakkuvat geeni või geene. Neid fragmente saab seejärel "kloonida" (st sisestada) või kleepida retsipiendi organismi fragmentidele.
Seejärel sisestatakse need suurematesse DNA molekulidesse ("rekombinantne plasmiid"), mis asetatakse bakteritesse ja lastakse paljuneda. Seejärel rekombinantne DNA taastatakse ja kontrollitakse.
Lisateavet rekombinantse DNA tehnoloogia plusside ja miinuste kohta.
DNA eraldamine
DNA tuleb kõigepealt ekstraheerida ja puhastada teistest rakumolekulidest, nagu ribonukleiinhapped (RNA), valgud ja struktuurid, näiteks rakumembraanid. Kloonimise eesmärgil saadakse DNA tuumast ja seda nimetatakse "genoomseks DNA-ks". Üks levinud meetod DNA jaoks ekstraheerimine toimub rakukomponentide ultracentrifuugimisega tsiidiumbromiidiga moodustunud tihedusgradientis kloriid.
Alternatiivina võib DNA taastamiseks kasutada ka rida leeliselisi ja soolapuhverpuhastusi. Kui see on sadestunud ja kõigist muudest soovimatutest saasteainetest puhastatud, saab DNA lõigata fragmentideks.
Piirava ensüümi DNA seedimine
Piiravad ensüümid on ensüümid, mis lõikavad väga spetsiifilisi DNA järjestusi; neid kasutatakse ainulaadsete DNA fragmentide loomiseks. See protsess tagab, et ebatäpseid, ebaõigeid või soovimatuid järjestusi ei genereerita ega muutuks - juhuslikult lisatud lõplikku rekombinantse DNA-sse, mis võib põhjustada nii katse ebaõnnestumist kui ka rakusurm.
Soovitud DNA fragmentide genereerimiseks kasutatakse DNA tükeldamiseks või seedimiseks spetsiifilist üksikut ensüümi (või nende kombinatsiooni). Seejärel puhastatakse fragmendid geelelektroforeesiga, mis eraldab need soovimatust DNA-st. Jämedama DNA tehnoloogia meetod hõlmab lihtsalt mehaanilist lõikamist, mis rebib pikemad DNA segmendid väiksemateks, mida saab kloonimiseks kasutada.
DNA ligeerimine
Ligeerimine on doonori ja retsipiendi (või vektori) DNA fragmentide ühendamise või ühendamise protsess rekombinantse plasmiidi DNA molekuli loomiseks. Ideaalis oleks fragmentide loomiseks valitud restriktsiooniensüümid väga hoolikalt läbi mõeldud ja kujundatud nii, et need võimaldaksid neid bitte kokku panna nagu puslet.
Selleks eelistatakse restriktsiooniensüüme, mis toodavad ühilduvaid "kleepuvaid otsi", nii et kõik ühilduvad fragmendid liituvad loomulikult üksteisega. Vastasel juhul saab DNA ligaasi ensüümi kasutada DNA segmentide ühendamiseks fosfodiestersidemetega.
Rekombinantse DNA replikatsioon
Rekombinantse DNA molekuli viimiseks peremeesorganismi bakterirakku kasutatakse transformatsiooniprotsessi või soojusšokki, mis võib seejärel genereerida palju sünteetilise DNA koopiaid. Neid baktereid kasvatatakse agarplaatidel, kultiveeritakse spetsiaalsetes bakteripuljongides ja lüüsitakse seejärel rekombinantse DNA vabastamiseks. Lõpuks saab DNA-d kontrollida DNA järjestamise, funktsionaalsete eksperimentide ja restriktsiooniensüümide seedimisega.
Kasutab rekombinantse DNA jaoks
Rekombinantse DNA tehnoloogiat kasutatakse kõike alates akadeemilistest laborikatsetest kuni farmatseutiliste ravimite loomiseni. See on ka oluline osa DNA järjestamisel ja geenide tuvastamisel.
Selle kohta saate lugeda rohkem abutavaid kasutusviise DNA-tehnoloogia siin.
Lisateavet rekombinantse DNA ja geenitehnoloogia erinevuse kohta.