Kõrgefektiivse vedelikkromatograafiaga (HPLC) töötamisel on usaldusväärse ja kvaliteetse tulemuse tagamiseks hädavajalik hea kalibreerimine. HPLC-seadme nõuetekohane kalibreerimine algab sobiva kalibreerimisstandardi valmistamisega. Enamikul juhtudel nõuab kalibreerimine rea kontsentratsiooni suurenemise standardeid, et saada nn kalibreerimiskõver. See on joonestatud joon ja sellega seotud võrrand, mis kirjeldab katsetatava kemikaali kontsentratsiooni ja HPLC detektori vastuse suhet.
Määrake kemikaal, mida soovite testida HPLC abil ("analüüd"). Näiteks võiksite testida karastusjookide seeriat fruktoosisisalduse osas, sel juhul oleks fruktoos analüüd.
Saadakse sobiva puhtusega analüüsitava kemikaali kogus. Tavaliselt peaks puhtus olema üle 99% ja analüüd tuleks osta mainekast keemiatarnete ettevõttest. Näiteks fruktoosi puhul ostaksite puhast fruktoosi kemikaalimüüjalt, mitte toidupoest.
Määrake analüüdi maksimaalne ja minimaalne eeldatav kontsentratsioon proovides, mida kavatsete HPLC abil testida. Karastusjookide puhul uuriksite jookide silte ja määraksite testitavate jookide seas madalaima ja kõrgeima fruktoosisisalduse. Pidage meeles, et analüüsiks ettevalmistamise ajal võib algproovi (karastusjooki) lahjendada või muul viisil manipuleerida (sõltuvalt kasutatavast HPLC-meetodist) ja seega võib analüüdi kontsentratsioon tegelikult HPLC-le süstitud proovides olla muudetud. Arvestada tuleb analüüdi kontsentratsiooni proovides, mis on tehtud HPLC abil.
Kalibreerimisstandardite saamiseks määrake lahusti, milles analüüdi lahustate. See lahusti peab suutma analüüdi korralikult lahustada suhteliselt laias kontsentratsioonivahemikus (vähemalt sama kõrge kui proovides, mida kavatsete katsetada). Samuti peaks see lahusti olema ideaalis üsna sarnane "liikuva faasiga": lahustiga, mida kasutatakse proovide kandmiseks läbi HPLC instrumendi.
Arvutage analüüdi põhistandardlahuse valmistamiseks vajalik analüüdi kogus. See leitakse, korrutades põhistandardi vajaliku kontsentratsiooni soovitud mahuga. Analüüdi kontsentratsioon selles lahuses peaks olema vähemalt 10% suurem kui eeldatav proovide suurim kontsentratsioon. Kui karastusjoogi proovis on eeldatav suurim eeldatav fruktoosikontsentratsioon 8 grammi / 100 milliliitri kohta, võib põhistandardi viia kontsentratsioonini 10 grammi fruktoosi / 100 milliliitrit. Mõistlik maht on 500 milliliitrit, seega oleks vaja fruktoosi 8/100 ml x 500 ml = 40 grammi.
Kaalutakse vajalik kogus analüüdi sobiva täpsusega. Sageli sobib kaalu väärtus grammides, täpsusega üks või kaks kohta pärast koma, kuid mõne meetodi puhul võib osutuda vajalikuks täpsem täpsus.
Kaalutud analüüt viiakse vajaliku mahuga mõõtekolbi ja lisatakse soovitud lahusti kolbi täitemärgile. Mõõtekolvi (näiteks mõõteklaasi asemel) kasutamine suurendab põhivarude kontsentratsiooni väärtuse täpsust. Veenduge, et kogu analüüd viiakse kolbi; vajadusel kasutage osa lahustist selle pesemiseks.
Tehakse põhistandardi erineva lahjendusega seeria, viies põhistandardi teadaolevad mahud mõõtekolbidesse, kasutades täpseks ülekandmiseks pipette, seejärel lisades lahustit. Madalaim standardkontsentratsioon peaks olema väiksem kui eeldatav madalaim analüüsitav proov. Karastusjoogi näites, kui madalaim eeldatav fruktoosi kontsentratsioon proovis on 2 grammi / 100 ml, siis võiks valmistada 1 grammi / 100 ml standardi. Selle saavutaks aktsiastandardi kümnekordne lahjendamine. Standardseeria peaks sisaldama kokku 5 või 6 kontsentratsiooni, seega oleks vaja täiendavaid lahjendusi, et saada standardid 3, 5 ja 8 grammi fruktoosi / ml. Nüüd on teil HPLC kalibreerimiseks rida standardlahuseid.