Naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforees (SDS-PAGE) on biokeemiline meetod valkude identifitseerimiseks lahuses. Nagu Mathews jt on kirjeldanud ajakirjas "Biochemistry", laaditakse valguproovid kõigepealt polüakrüülamiidgeeli ploki ühe otsa "aukudesse" või aukudesse. Seejärel kantakse geelile elektriväli. Laetud proovidele lisatud SDS eitab valkude loomulikku laengut. Sel põhjusel määrab ainult valgu molekulmass valkude migratsioonikiiruse, kui nad liiguvad geeli kaudu positiivselt laetud pooluse suunas, märgib Bitesize Bio. Mitmed valgud samas proovis eralduvad seetõttu üksteisest ja migreeruvad erinevatesse asenditesse.
Orienteerige geelfoto. "Top" on kaevude asukoht, kuhu proovid algselt lisati. "Alumine" on koht, kuhu proovid rändasid ja sisaldab kõige sagedamini värvirinda, mis näitab proovide migreeruvat fronti. Kas vasakul või paremal peaks olema "marker", mida kasutatakse prognoositava molekulmassijuhina.
Märgistage iga raja proovid. Ülaosas on kaevudesse lisatud proovid liikunud vertikaalselt "rada" pidi. Seetõttu tulid kõik vertikaalses veerus nähtavad ribad ühest proovist, mis oli laaditud otse selle kohale. Kasutage joonlauda ja pliiatsit, kui soovite veerge visualiseerida, ribadele rajada.
Märgistage ribaradade molekulsuurused markerirajal. Kaubanduslikult saadaval olevatel markeritel on oodatav riba mustri pilt koos iga riba molekulmassiga. Ribad on tumedad horisontaalsed "kangid", mis on tegelikult geelisse peidetud plekiline valk.
Joonistage kerged horisontaaljooned, mis ulatuvad igast markerribast geeli vastasservani. Olge ettevaatlik, et need jooned oleksid paralleelsed kaevude ja värvaine esiküljega. Need jooned näitavad, kus igas ribas asetsevad molekulmassiga valgud paikneksid igas reas. Näiteks 4. rööbastee riba, mis asub vahetult joone all, ulatub 25-kilodaltonist markerriba järgi võib arvata, et rada 4 on molekulaarselt peaaegu 25 kilodaltoni, kuid mitte päris kaal.
Märgistage igas ribas iga riba hinnanguline molekulmass. Kasutage markereid juhendina ja hinnake väärtusi markerite suuruste vahel.
Geelfoto alla tehke iga raja kohta loetelu "valkudest". Alustuseks märkige, mis on iga proovi kohta teada, näiteks selle päritolu või tingimused. Seejärel loetlege iga riba hinnanguline molekulmass rajal. Ühe ribaga rajad näitavad, et proov sisaldab ainult ühte valku. Mitme ribaga rajad näitavad mitme valgu olemasolu. Migratsioonirindega töötavad ribad on väiksemad, kui soovitab lähim marker, ja tõenäoliselt ei saa neid ennustada, välja arvatud juhul, kui marker näitab "väiksemat".
Valkude loendis märkige kummalisused. "Määrdunud" välimus võib viidata sellele, et valke on liiga palju või et proovi viskoossus mõjutas selle rännet. Kui ribad näivad ületavat sõiduraja servas või on teiste ribadega võrreldes üsna suured, siis on selle valgu kontsentratsioon tõenäoliselt liiga kõrge ja seda tuleks tulevikus lahjendada elektroforees. Hallikas toon kogu sõidurajal, tumedam kui taustageeli värv, näitab eristamatuid valgufragmente.
Määrake valkude identiteet igas reas. Kuigi seda tehakse ainult molekulmassiga, näitab tõenäoliselt ka iga raja allikas vihjeid. Mõelge, et teatud tingimustel võivad valgud geelil säilitada dimeeri või trimeri seose. Seetõttu võib üks valk geelil ilmuda kolme erineva ribana. Isegi kui valke ei ole võimalik tuvastada, võib ribade suhteline tumedus viidata valkude kontsentratsioonidele lahuses. Kõik uudishimulikud ja tundmatud valgud saab isoleerida otse originaalgeelist ja saata identifitseerimiseks.
Asjad, mida vajate
- Värvitud SDS-PAGE geeli foto
- Kasutatud molekulmassimarkeri võti
- Valitseja
- Pliiats