Electroforesis en gel es una técnica de laboratorio de uso común con muchas aplicaciones prácticas que incluyen huellas dactilares de ADN y secuenciación del genoma. El proceso implica separar ADN fragmentos usando una corriente eléctrica mientras se rastrea la tasa de movimiento molecular a través de un gel filtrante.
Agregar tinte de rastreo azul o naranja a muestras de ADN incoloras le permite ver su muestra y obtener información sobre cómo se mueven las moléculas de ADN durante la electroforesis. La identificación se basa en el tamaño de las bandas de ADN en el gel después de la migración de moléculas.
Cómo funciona la electroforesis en gel
Electroforesis en gel extrae fragmentos de ADN a través de un gel utilizando una corriente eléctrica para aislar e identificar las moléculas de ADN por tamaño y carga eléctrica. El gel a menudo se elabora con polvo de agarosa - un polisacárido extraído de algas marinas.
Se agrega agarosa a una solución tampón de agua y sal, y la mezcla se calienta y enfría para formar un gel poroso que actuará como matriz filtrante durante el procedimiento de electroforesis. Luego, el gel se coloca en una unidad de electroforesis y se cubre con una solución tampón que conduce
electricidad.Las soluciones que contienen ADN y colorantes de carga se pipetean en pequeños pocillos del gel que deben prepararse durante la preparación del gel. Tintesayudartever claramente la muestra que está agregando a los pocillos de gel ubicados cerca del electrodo negativo de la unidad de electroforesis.
Un electrodo positivo se encuentra en el extremo opuesto. Se coloca un estándar conocido de fragmentos de ADN en el primer pozo que creará una escalera de bandas de ADN con fines de comparación e identificación.
La columna vertebral de fosfato de las moléculas de ADN le da al ADN una carga negativa. Los opuestos se atraen, por lo tanto, las moléculas de ADN son atraídas por el electrodo positivo y comienzan a moverse, o "migrar", cuando se enciende una corriente eléctrica.
Los fragmentos de ADN de menor tamaño viajan más rápido que los fragmentos más grandes porque encuentran menos resistencia a medida que migran a través de la matriz porosa del gel. Los fragmentos de ADN de tamaño similar forman bandas de ADN en el gel.
Cargar el propósito e importancia del tinte
El ADN es incoloro, por lo que agregar tintes de seguimiento a una muestra te ayuda determinar la tasa de movimiento de moléculas de proteína de diferentes tamaños en el gel durante la electroforesis. Ejemplos de colorantes de carga que se mueven con la muestra de ADN incluyen bromofenolazul y xileno cianol.
El tinte elegido no debe ser reactivo ni alterar el ADN. El azul de bromofenol es un tinte que se utiliza para rastrear cadenas de ADN de menor tamaño que contienen aproximadamente 400 pares de bases, mientras que el xileno cianol es mejor para cadenas de ADN más grandes con hasta 8.000 pares de bases. El tinte elegido no debe ser reactivo ni alterar el ADN.
Papel del glicerol en la electroforesis en gel de agarosa
Al preparar su muestra de ADN para electroforesis, deberá agregar glicerol y agua junto con los tintes de carga. El glicerol es una sustancia espesa y almibarada que le da más densidad a la muestra de ADN antes de que se inserte en los pocillos en un extremo de la hoja de gel.
Sin glicerol, la muestra de ADN se dispersaría en lugar de hundirse y formar una capa en el pozo como se supone que debe hacer para formar una escalera de ADN.
Seguimiento de tinte en la PÁGINA SDS
La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) es una técnica adecuada para separar proteínas y aminoácidos, que son más pequeños y más complejos que las moléculas lineales de ADN. Se utiliza poliacrilamida (gel SDS PAGE) en lugar de gel de agarosa para la electroforesis.
Se agrega azul de bromofenol (BPB) al tampón de muestra como tinte de seguimiento que se mueve en la misma dirección de separación de proteínas y delimita su borde de ataque.
Papel del tinte de unión al ADN
Tinte de unión al ADN como color naranja Puede añadirse bromuro de etidio al gel o al tampón de electroforesis. Como sugiere el nombre, el tinte se adhiere a la molécula de ADN.
Se debe tener mucho cuidado al manipular este tinte mutagénico porque puede unirse al ADN en las células de la piel. A diferencia de los tintes de seguimiento, el bromuro de etidio fluoresce brillantemente bajo luz ultravioleta, haciendo visibles las bandas de ADN.