Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι μια τεχνική όπου τα βιολογικά μόρια διαχωρίζονται μεταξύ τους και ταυτοποιούνται σε βιολογική έρευνα ή ιατρική διάγνωση. Από την ανάπτυξή τους στη δεκαετία του 1970, αυτές οι τεχνικές ήταν πολύτιμες για τον εντοπισμό γονιδίων (DNA) και γονιδιακών προϊόντων (RNA και πρωτεΐνης) ερευνητικού ενδιαφέροντος. Τα τελευταία χρόνια, έχουν προκύψει νεότερες τεχνικές που δίνουν μεγαλύτερη ειδικότητα και λεπτομέρεια σχετικά με το τι συμβαίνει στα ζωντανά συστήματα. Αν και αυτές δεν έχουν αντικαταστήσει τεχνικές ηλεκτροφόρησης, και οι προηγμένοι χειρισμοί μπορούν να επεκτείνουν τη βιωσιμότητα της τεχνικής, είναι σημαντικό να συνειδητοποιήσουμε τι μπορεί να κάνει και τι δεν μπορεί να κάνει η ηλεκτροφόρηση γέλης.
Η ηλεκτροφόρηση έχει περιορισμένη ανάλυση δείγματος
Η ηλεκτροφόρηση είναι συγκεκριμένη για οποιονδήποτε ιστό έχετε δειγματοληψία. Για παράδειγμα, εάν εκτελέσετε κηλίδα Southern (ένας τύπος ηλεκτροφόρησης) σε ένα μάκτρο μάγουλου, κοιτάζετε γονίδια από τα επιθηλιακά κύτταρα του μάγουλου σας και πουθενά αλλού στο σώμα σας. Μερικές φορές, αυτό μπορεί να είναι επωφελές, αλλά οι ερευνητές συχνά ενδιαφέρονται για ευρύτερα αποτελέσματα.
Τεχνικές όπως η in situ υβριδοποίηση (ISH) μπορούν να πάρουν ένα τμήμα ιστού και να αναλύσουν τη γονιδιακή έκφραση σε κάθε μικρή περιοχή αυτού του δείγματος. Έτσι, οι ερευνητές μπορούν να εξετάσουν κάθε περιοχή του εγκεφάλου σε ένα δείγμα με ISH, ενώ οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης μπορούν να δουν μόνο μερικές περιοχές κάθε φορά.
Οι μετρήσεις ηλεκτροφόρησης δεν είναι ακριβείς
Η ηλεκτροφόρηση γέλης μπορεί αποτελεσματικά να διαχωρίσει παρόμοιες πρωτεΐνες με διαφορετικά βάρη (αυτή είναι μια τεχνική που ονομάζεται στύπωμα Western). Μπορεί να τα διαχωρίσει με μεγαλύτερη ακρίβεια μέσω μιας τεχνικής γνωστής ως 2ο ηλεκτροφόρηση. αυτό είναι συνηθισμένο στην πρωτεωμική.
Δυστυχώς, όλες οι μετρήσεις που έγιναν από αυτήν την τεχνική είναι ημι-ποσοτικές στην καλύτερη περίπτωση. Προκειμένου να ληφθεί η ακριβής μάζα (βάρος) πρωτεϊνών, πρέπει να χρησιμοποιηθεί φασματοσκοπία μάζας μετά την καθαρισμό της πρωτεΐνης με ηλεκτροφόρηση. Επιπλέον, η σύγκριση των σχετικών ποσοτήτων διαφορετικών μορίων εξαρτάται από την πυκνότητα ζώνης (σκοτάδι) διαφορετικών κηλίδων στο πήκτωμα. Αυτή η μέθοδος έχει κάποιο βαθμό σφάλματος και τα δείγματα εκτελούνται συνήθως πολλές φορές για να πάρουν καθαρά αποτελέσματα.
Απαιτείται ουσιαστικό δείγμα έναρξης
Η ηλεκτροφόρηση είναι μια τεχνική απομόνωσης και οπτικής αναγνώρισης διαφορετικών βιομορίων. Αυτό γίνεται με τη διέλευση ενός ηλεκτρικού ρεύματος μέσω της γέλης για τον διαχωρισμό φορτισμένων μορίων διαφορετικών βαρών. Εάν το μόριο που σας ενδιαφέρει δεν είναι αρκετά κοινό, η ζώνη του θα είναι σχεδόν αόρατη και δύσκολο να μετρηθεί.
Το DNA και το RNA μπορούν να ενισχυθούν κάπως πριν από την εκτέλεση ηλεκτροφόρησης, αλλά δεν είναι πρακτικό να γίνει αυτό με πρωτεΐνες. Επομένως, απαιτείται ένα μεγάλο δείγμα ιστού για την εκτέλεση αυτών των προσδιορισμών. Αυτό μπορεί να περιορίσει τη χρησιμότητα της τεχνικής, ειδικά στην ιατρική ανάλυση. Είναι σχεδόν αδύνατο να εκτελεστεί ηλεκτροφόρηση σε δείγματα από ένα μόνο κύτταρο. Η κυτταρομετρία ροής και η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιούνται συχνότερα για την εκτίμηση της έκφρασης πρωτεϊνών από κύτταρο σε κύτταρο. Μια τεχνική που ονομάζεται PCR είναι εξαιρετική για την ακριβή μέτρηση μικρών ποσοτήτων RNA.
Μόνο ορισμένα μόρια μπορούν να οπτικοποιηθούν
Η ηλεκτροφόρηση είναι εξαιρετική στο διαχωρισμό και τον εντοπισμό βιομορίων μεσαίου έως μεγάλου μεγέθους. Ωστόσο, πολλά από τα μόρια που οι ερευνητές επιθυμούν να εξετάσουν είναι μικρότερα. μικρές ορμόνες, νευροδιαβιβαστές και ιόντα δεν μπορούν να μετρηθούν με ηλεκτροφόρηση. Αυτό συμβαίνει για δύο λόγους: δεν αντιδρούν σωστά με το παρασκεύασμα ηλεκτροφόρησης (συνήθως μια τεχνική ονομάζεται SDS PAGE) και, ακόμη και αν το έκαναν, είναι πολύ μικρά για να διαχωριστούν σωστά και θα βγουν έξω από το κάτω μέρος του το τζελ. Αυτά τα μόρια μετρώνται αντ 'αυτού με τεχνικές όπως RIAAs (ραδιο ανοσοπροσδιορισμοί) και ELISAs (ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία).
Η ηλεκτροφόρηση είναι χαμηλής απόδοσης
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι γενικά χαμηλή απόδοση, που σημαίνει ότι δεν παράγει δεδομένα ιδιαίτερα γρήγορα. Ηλεκτροφόρηση αντίθεσης, όπου μπορείτε να δείτε μια μικρή χούφτα μόρια RNA κάθε φορά, με PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης), η οποία μπορεί ταυτόχρονα να αξιολογήσει χιλιάδες δείγματα. Ομοίως, η κυτταρομετρία ροής μπορεί να λάβει μετρήσεις από χιλιάδες μεμονωμένα κύτταρα και να γίνει περίπλοκη συσχετίσεις, ενώ η ηλεκτροφόρηση εξετάζει τα κύτταρα μαζικά και δεν μπορεί να κάνει τόσο ωραία διακρίσεις. Η PCR και η κυτταρομετρία ροής αντιπροσωπεύουν μαζικά παράλληλες και σειριακές διαδικασίες αντίστοιχα, και και οι δύο ξεπερνούν κατά πολύ τις ικανότητες της ηλεκτροφόρησης να δημιουργούν ερευνητικά δεδομένα.