Κλωνοποίηση DNA: Ορισμός, Διαδικασία, Παραδείγματα

Είναι δυνατόν να κλωνοποιηθούν ολόκληροι οργανισμοί όπως η Dolly the πρόβατα, αλλά η κλωνοποίηση DNA είναι διαφορετική. Χρησιμοποιεί τεχνικές μοριακής βιολογίας για να φτιάξει πανομοιότυπα αντίγραφα αλληλουχιών DNA ή μεμονωμένων γονιδίων.

Χρησιμοποιώντας μεθόδους γενετικής μηχανικής, τα τμήματα του γενετικού κώδικα DNA αναγνωρίζονται και απομονώνονται. Στη συνέχεια, η κλωνοποίηση DNA αντιγράφει το νουκλεϊκό οξύ ακολουθίες στα τμήματα.

Τα προκύπτοντα ίδια αντίγραφα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω έρευνα ή για εφαρμογές βιοτεχνολογίας. Συχνά το γονίδιο που αντιγράφεται κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που μπορεί να αποτελεί μέρος ιατρικών θεραπειών. Η τεχνολογία DNA περιλαμβάνει Κλωνοποίηση DNA υποστηρίζει την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας των γονιδίων και του πώς ο γενετικός κώδικας των ανθρώπων επηρεάζει τη λειτουργία του σώματος.

Η κλωνοποίηση DNA είναι η διαδικασία της μοριακής βιολογίας της δημιουργίας πανομοιότυπων αντιγράφων τμημάτων DNA που βρίσκονται στα χρωμοσώματα που περιέχουν τον γενετικό κώδικα προηγμένων οργανισμών.

Η διαδικασία παράγει μεγάλες ποσότητες αλληλουχίες DNA στόχου. Ο σκοπός της κλωνοποίησης DNA είναι να παράγουν οι ίδιες τις αλληλουχίες DNA στόχου ή να παράγουν τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται στις αλληλουχίες στόχους.

Οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην κλωνοποίηση DNA ονομάζονται φορέα πλασμιδίου και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Στο φορέα πλασμιδίου μέθοδος, οι κλώνοι DNA κόβονται χρησιμοποιώντας ένζυμα περιορισμού για την παραγωγή θραυσμάτων DNA, και τα προκύπτοντα τμήματα εισάγονται σε φορείς κλωνοποίησης που ονομάζονται πλασμίδια για περαιτέρω αναπαραγωγή. Τα πλασμίδια τοποθετούνται σε βακτηριακά κύτταρα που στη συνέχεια παράγουν αντίγραφα DNA ή κωδικοποιημένες πρωτεΐνες.

Στο Μέθοδος PCR, το τμήμα των κλώνων DNA που πρόκειται να αναπαραχθεί επισημαίνεται με ένζυμα που ονομάζονται εκκινητές. Ένα ένζυμο πολυμεράσης δημιουργεί αντίγραφα του σημειωμένου τμήματος του κλώνου DNA. Αυτή η μέθοδος δεν χρησιμοποιεί περιοριστικά ένζυμα και μπορεί να παράγει κλωνοποιημένο DNA από μικρά δείγματα. Μερικές φορές οι δύο μέθοδοι τεχνολογίας DNA χρησιμοποιούνται μαζί για να ενσωματώσουν τα καλύτερα χαρακτηριστικά του καθενός σε μια συνολική αντίδραση.

Ο φορέας της μεθόδου αναφέρεται στο πλασμίδιο που χρησιμοποιείται για να συγκρατεί το τμήμα DNA στόχου που πρόκειται να κλωνοποιηθεί. Τα πλασμίδια είναι μικρά κυκλικά σκέλη μη χρωμοσωμικό DNA βρίσκονται σε πολλούς οργανισμούς, συμπεριλαμβανομένων βακτηρίων και ιών.

Τα βακτηριακά πλασμίδια είναι ο φορέας που χρησιμοποιείται για την εισαγωγή του τμήματος ϋΝΑ στόχου σε βακτηριακά κύτταρα για περαιτέρω αναπαραγωγή.

Επιλογή και απομόνωση του DNA στόχου: Πριν ξεκινήσει η διαδικασία κλωνοποίησης DNA, πρέπει να ταυτοποιηθούν οι αλληλουχίες DNA, ειδικά οι αρχές και τα άκρα των τμημάτων DNA.

Τέτοιες αλληλουχίες DNA μπορούν να βρεθούν χρησιμοποιώντας υπάρχον κλωνοποιημένο DNA με γνωστές αλληλουχίες ή μελετώντας την πρωτεΐνη που παράγεται από την αλληλουχία DNA στόχου. Μόλις γίνει γνωστή η αλληλουχία, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τα αντίστοιχα περιοριστικά ένζυμα.

Κοπή του DNA στόχου με περιοριστικά ένζυμα: Τα ένζυμα περιορισμού επιλέγονται για να αναζητήσουν τον κωδικό DNA στην αρχή και στο τέλος των αλληλουχιών-στόχων.

Όταν τα ένζυμα περιορισμού βρίσκουν μια ειδική κωδικοποιημένη αλληλουχία ζευγών βάσεων που ονομάζονται θέσεις περιορισμού, αυτά να προσκολληθούν στο DNA σε αυτήν τη θέση και να τυλίξουν γύρω από το μόριο DNA, διακόπτοντας το νήμα. Τα κομμένα τμήματα DNA που περιέχουν την αλληλουχία στόχο είναι πλέον διαθέσιμα για επανάληψη.

Επιλογή του φορέα πλασμιδίου και εισαγωγή του DNA στόχου: Ένα κατάλληλο πλασμίδιο περιέχει ιδανικά τις ίδιες αλληλουχίες κωδικοποίησης DNA με τον κλώνο DNA από τον οποίο κόπηκε το DNA στόχος. Ο κυκλικός κλώνος DNA του πλασμιδίου κόβεται με τα ίδια περιοριστικά ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν για την κοπή του DNA στόχου.

ΕΝΑ Ένζυμο λιγάσης DNA χρησιμοποιείται για την προώθηση της σύνδεσης τμήματος DNA, και τα άκρα του τμήματος DNA στόχου συνδέονται με τα κομμένα άκρα του DNA πλασμιδίου. Το DNA στόχος αποτελεί πλέον μέρος του κυκλικού κλώνου DNA πλασμιδίου.

Εισαγωγή του πλασμιδίου σε ένα βακτηριακό κύτταρο: Μόλις το πλασμίδιο περιέχει την αλληλουχία DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί, η πραγματική κλωνοποίηση μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας μια διαδικασία που ονομάζεται βακτηριακός μετασχηματισμός. Τα πλασμίδια εισάγονται σε ένα βακτηριακό κύτταρο όπως το Ε. coli, και τα κύτταρα με τα νέα τμήματα DNA θα αρχίσουν να παράγουν αντίγραφα και τις αντίστοιχες πρωτεΐνες.

Στον βακτηριακό μετασχηματισμό, τα κύτταρα ξενιστές και τα πλασμίδια επωάζονται μαζί σε θερμοκρασία σώματος για περίπου 12 ώρες. Τα κύτταρα απορροφούν μερικά από τα πλασμίδια και τα αντιμετωπίζουν ως το δικό τους πλασμιδικό DNA.

Συγκομιδή του κλωνοποιημένου DNA και πρωτεϊνών: Τα περισσότερα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται για κλωνοποίηση DNA έχουν γονίδια αντοχής στα αντιβιοτικά ενσωματωμένο στο DNA τους. Καθώς τα βακτηριακά κύτταρα απορροφούν τα νέα πλασμίδια, γίνονται ανθεκτικά στα αντιβιοτικά.

Όταν η καλλιέργεια αντιμετωπίζεται με αντιβιοτικά, σώζονται μόνο εκείνα τα κύτταρα που έχουν απορροφήσει τα νέα πλασμίδια. Το αποτέλεσμα είναι μια καθαρή καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων με κλωνοποιημένο DNA. Αυτό το DNA μπορεί στη συνέχεια να συλλεχθεί ή μπορεί να παραχθεί η αντίστοιχη πρωτεΐνη.

ο PCR Η μέθοδος είναι απλούστερη και αντιγράφει το υπάρχον DNA στη θέση του. Δεν απαιτεί κοπή με περιοριστικά ένζυμα ή εισαγωγή πλασμίδιοDNA ακολουθίες. Αυτό το καθιστά ιδιαίτερα κατάλληλο για κλωνοποίηση δειγμάτων DNA με περιορισμένο αριθμό κλώνων DNA. Ενώ η μέθοδος μπορεί να κλωνοποιήσει το DNA, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης.

Ξετυλίγοντας τους κλώνους του DNA: Το DNA στα χρωμοσώματα τυλίγεται σφιχτά σε μια δομή διπλής έλικας. Θέρμανση του DNA στους 96 βαθμούς Κελσίου σε μια διαδικασία που ονομάζεται μετουσίωση κάνει το μόριο DNA να ξετυλίγεται και να διαχωρίζεται σε δύο κλώνους. Αυτός ο διαχωρισμός απαιτείται επειδή μόνο ένας κλώνος DNA μπορεί να κλωνοποιηθεί ταυτόχρονα.

Επιλογή των εκκινητών: Όπως με την κλωνοποίηση ϋΝΑ φορέα πλασμιδίου, οι αλληλουχίες DNA προς κλωνοποίηση πρέπει να ταυτοποιηθούν με ιδιαίτερη έμφαση στις αρχές και τα άκρα των τμημάτων DNA. Οι εκκινητές είναι ένζυμα που συνδέονται με συγκεκριμένες αλληλουχίες κωδικού DNA και πρέπει να επιλεγούν για να επισημάνουν τα τμήματα DNA στόχου. Οι σωστοί εκκινητές θα προσκολληθούν στις αλληλουχίες μορίων DNA για να σηματοδοτήσουν τις αρχές και τα άκρα των τμημάτων στόχων.

Ανόπτηση της αντίδρασης για δέσμευση των εκκινητών: Η ψύξη της αντίδρασης σε περίπου 55 βαθμούς Κελσίου καλείται ανόπτηση. Καθώς η αντίδραση ψύχεται, οι εκκινητές ενεργοποιούνται και προσκολλούνται στον κλώνο DNA σε κάθε άκρο ενός τμήματος ϋΝΑ στόχου. Τα αστάρια δρουν μόνο ως δείκτες και ο κλώνος DNA δεν χρειάζεται να κοπεί.

Παραγωγή πανομοιότυπων αντιγράφων του τμήματος DNA στόχου: Σε μια διαδικασία που ονομάζεται επέκταση, το ευαίσθητο στη θερμότητα ένζυμο πολυμεράσης TAQ προστίθεται στην αντίδραση. Η αντίδραση στη συνέχεια θερμαίνεται στους 72 βαθμούς Κελσίου, ενεργοποιώντας το ένζυμο. Το ενεργό ένζυμο DNA πολυμεράσης συνδέεται με τους εκκινητές και αντιγράφει την αλληλουχία DNA μεταξύ τους. Η αρχική διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας και κλωνοποίησης DNA έχει ολοκληρωθεί.

Αυξάνοντας την απόδοση του κλωνοποιημένου DNA: Η αρχική διαδικασία ανόπτησης και επέκτασης δημιουργεί σχετικά λίγα αντίγραφα των διαθέσιμων τμημάτων κλώνου DNA. Για να αυξηθεί η απόδοση μέσω επιπρόσθετης αντιγραφής DNA, η αντίδραση ψύχεται και πάλι για να ενεργοποιηθεί εκ νέου οι εκκινητές και να τους αφήσει να συνδεθούν με άλλους κλώνους DNA.

Στη συνέχεια, η επαναθέρμανση της αντίδρασης ενεργοποιεί ξανά το ένζυμο πολυμεράσης και παράγονται περισσότερα αντίγραφα. Αυτός ο κύκλος μπορεί να επαναληφθεί 25 έως 30 φορές.

Η μέθοδος φορέα πλασμιδίου βασίζεται σε μια άφθονη αρχική παροχή DNA για κοπή και εισαγωγή σε πλασμίδια. Πολύ λίγο πρωτότυπο DNA έχει ως αποτέλεσμα λιγότερα πλασμίδια και μια αργή έναρξη της κλωνοποιημένης παραγωγής DNA.

Η μέθοδος PCR μπορεί να παράγει μεγάλη ποσότητα DNA από λίγους αρχικούς κλώνους DNA, αλλά επειδή το DNA δεν εμφυτεύεται σε βακτηριακό κύτταρο, η παραγωγή πρωτεϊνών δεν είναι δυνατή.

Για να παραχθεί η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται στα θραύσματα DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθούν από ένα μικρό αρχικό δείγμα DNA, οι δύο μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν μαζί και μπορούν αλληλοσυμπληρώνονται. Πρώτα, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση DNA από ένα μικρό δείγμα και την παραγωγή πολλών αντιγράφων.

Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR χρησιμοποιούνται με τη μέθοδο φορέα πλασμιδίου για την εμφύτευση του παραγόμενου DNA σε βακτηριακά κύτταρα που θα παράγουν την επιθυμητή πρωτεΐνη.

Η μοριακή βιολογία χρησιμοποιεί κλωνοποίηση γονιδίων και αντιγραφή DNA για ιατρικούς και εμπορικούς σκοπούς. Τα βακτήρια με κλωνοποιημένες αλληλουχίες DNA χρησιμοποιούνται για την παραγωγή φαρμάκων και την αντικατάσταση ουσιών που δεν μπορούν να παράγουν τα άτομα με γενετικές διαταραχές.

Οι τυπικές χρήσεις περιλαμβάνουν:

• Το γονίδιο για ανθρώπινη ινσουλίνη κλωνοποιείται σε βακτήρια που στη συνέχεια παράγουν την ινσουλίνη που χρησιμοποιείται από διαβητικούς.
• Ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου ιστού παράγεται από κλωνοποιημένο DNA και χρησιμοποιείται για να βοηθήσει πρόληψη θρόμβων αίματος.
• Ανθρώπινη αυξητική ορμόνη μπορεί να παραχθεί και να χορηγηθεί σε άτομα που δεν μπορούν να το παράγουν μόνοι τους.

Η βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί επίσης την κλωνοποίηση γονιδίων στη γεωργία για να δημιουργήσει νέα χαρακτηριστικά σε φυτά και ζώα ή να ενισχύσει τα υπάρχοντα χαρακτηριστικά. Καθώς κλωνοποιούνται περισσότερα γονίδια, ο αριθμός των πιθανών χρήσεων αυξάνεται εκθετικά.

Τα μόρια DNA αποτελούν ένα μικρό κλάσμα του υλικού σε ένα ζωντανό κύτταρο και είναι δύσκολο να απομονωθούν οι επιρροές των πολλών γονιδίων. Οι μέθοδοι κλωνοποίησης DNA παρέχουν μεγάλες ποσότητες μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA για μελέτη και το DNA παράγει πρωτεΐνες όπως έκανε στο αρχικό κύτταρο. Η κλωνοποίηση DNA καθιστά δυνατή τη μελέτη αυτής της λειτουργίας για διαφορετικά γονίδια μεμονωμένα.

Οι τυπικές εφαρμογές έρευνας και τεχνολογίας DNA περιλαμβάνουν την εξέταση:

• Λειτουργία ενός γονιδίου.
• Μεταλλάξεις ενός γονιδίου.
• Γονιδιακή έκφραση.
• Προϊόντα γονιδίων.
• Γενετικά ελαττώματα.

Όταν κλωνοποιούνται περισσότερες αλληλουχίες DNA, είναι ευκολότερο να βρεθούν και να κλωνοποιηθούν επιπλέον αλληλουχίες. Τα υπάρχοντα κλωνοποιημένα τμήματα DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστεί εάν ένα νέο τμήμα ταιριάζει με το παλιό και ποια μέρη είναι διαφορετικά. Ο εντοπισμός μιας ακολουθίας DNA στόχου είναι τότε πιο γρήγορος και ακριβέστερος.

Σε γονιδιακή θεραπεία, ένα κλωνοποιημένο γονίδιο παρουσιάζεται στα κύτταρα ενός οργανισμού του οποίου το φυσικό γονίδιο είναι κατεστραμμένο. Ένα ζωτικό γονίδιο που παράγει μια πρωτεΐνη που απαιτείται για μια συγκεκριμένη λειτουργία του οργανισμού θα μπορούσε να μεταλλαχθεί, να αλλάξει από την ακτινοβολία ή να επηρεαστεί από ιούς.

Όταν το γονίδιο δεν λειτουργεί σωστά, μια σημαντική ουσία λείπει από το κύτταρο. Η γονιδιακή θεραπεία προσπαθεί αντικαταστήστε το γονίδιο με μια κλωνοποιημένη έκδοση που θα παράγει την απαιτούμενη ουσία.

Η γονιδιακή θεραπεία εξακολουθεί να είναι πειραματική και λίγοι ασθενείς έχουν θεραπευτεί χρησιμοποιώντας την τεχνική. Τα προβλήματα έγκειται στον εντοπισμό του μοναδικού γονιδίου που είναι υπεύθυνο για μια ιατρική κατάσταση και την παράδοση πολλών αντιγράφων του γονιδίου στα σωστά κύτταρα. Καθώς η κλωνοποίηση του DNA έχει γίνει πιο διαδεδομένη, η γονιδιακή θεραπεία έχει εφαρμοστεί σε διάφορες συγκεκριμένες καταστάσεις.

Οι πρόσφατες επιτυχημένες εφαρμογές περιλαμβάνουν:

• Νόσος του Πάρκινσον: Χρησιμοποιώντας έναν ιό ως φορέα, ένα γονίδιο που σχετίζεται με τη νόσο του Πάρκινσον εγχύθηκε στους μεσαίους εγκέφαλους των ασθενών. Οι ασθενείς παρουσίασαν βελτιωμένες κινητικές δεξιότητες χωρίς παρενέργειες.
• Ανεπάρκεια αδενοσίνης απαμινάσης (ADA): Μια γενετική ανοσολογική διαταραχή αντιμετωπίστηκε αφαιρώντας τα βλαστικά κύτταρα του αίματος των ασθενών και εισάγοντας το γονίδιο ADA. Οι ασθενείς μπόρεσαν να παράγουν τουλάχιστον μερικά από τα δικά τους ADA ως αποτέλεσμα.
• Αιμοφιλία: Τα άτομα με αιμορροφιλία δεν παράγουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες που βοηθούν στην πήξη του αίματος. Ένα γονίδιο για την παραγωγή μίας από τις πρωτεΐνες που λείπουν εισήχθη στα ηπατικά κύτταρα των ασθενών. Οι ασθενείς παρήγαγαν την πρωτεΐνη και τα περιστατικά αιμορραγίας μειώθηκαν.

Η γονιδιακή θεραπεία είναι μία από τις πιο ελπιδοφόρες εφαρμογές της κλωνοποίησης DNA, αλλά άλλες νέες χρήσεις είναι πιθανό να πολλαπλασιαστούν καθώς μελετώνται περισσότερες αλληλουχίες DNA και προσδιορίζεται η λειτουργία τους. Η κλωνοποίηση DNA παρέχει την πρώτη ύλη για γενετική μηχανική στις απαιτούμενες ποσότητες.

Όταν ο ρόλος των γονιδίων είναι γνωστός και μπορεί να διασφαλιστεί η σωστή λειτουργία τους μέσω αντικατάστασης ελαττωματικών γονίδια, πολλές χρόνιες ασθένειες και ακόμη και καρκίνος μπορούν να προσβληθούν και να αντιμετωπιστούν σε γενετικό επίπεδο χρησιμοποιώντας DNA τεχνολογία.

Σχετικό περιεχόμενο:

• Χαρακτηριστικά αποικίας του E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Ορισμός, Λειτουργία, Δομή