Στην ηλεκτροφόρηση γέλης, δείγματα DNA ή πρωτεϊνών διαχωρίζονται - συνήθως με βάση το μέγεθος - εφαρμόζοντας ένα ηλεκτρικό πεδίο που τους προκαλεί να μεταναστεύσουν μέσω ενός πηκτώματος. Η χρήση ηλεκτροφόρησης γέλης είναι ρουτίνα σε εργαστήρια βιοϊατρικής έρευνας και χρησιμοποιείται για να απαντήσει σε μια ποικιλία διαφορετικών ερωτήσεων, οπότε δεν υπάρχει πραγματικά ένας καθολικός τρόπος ανάλυσης των αποτελεσμάτων.
Διαφορετικές τεχνικές όπως η κηλίδωση Western, η κηλίδα Northern και η κηλίδα Southern, για παράδειγμα, περιλαμβάνουν όλες ηλεκτροφόρηση πηκτής.
Εάν το κάνετε γέλη αγαρόζης ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA, το πιο συνηθισμένο είδος διαδικασίας, συνήθως θα πρέπει να κάνετε τουλάχιστον δύο πράγματα: 1) να ξεχωρίσετε τα άκοπα πλασμίδια από ένθετα, πλασμίδια με ψευδώνυμα και κομμένα πλασμίδια και, 2) εκτιμούν το μέγεθος των διαφόρων θραυσμάτων DNA με μια τυπική καμπύλη Excel ή αριθμομηχανή.
Ελέγξτε το εργαστηριακό σημειωματάριό σας για να προσδιορίσετε ποια δείγματα τοποθετήθηκαν σε ποιες λωρίδες. Όταν φορτώσατε τα φρεάτια για το τζελ σας, θα έπρεπε να έχετε σημειώσει την ταυτότητα κάθε λωρίδας / δείγματος.
Χρησιμοποιώντας έναν χάρακα, μετρήστε την απόσταση στην εικόνα σας από τα πηγάδια έως τη βαφή παρακολούθησης, κάτι που θα συμβεί έχουν ταξιδέψει περισσότερο από οποιαδήποτε από τις ζώνες DNA (με άλλα λόγια, θα είναι στο κάτω μέρος του γέλη). Καταγράψτε αυτόν τον αριθμό - οι μονάδες που χρησιμοποιείτε δεν είναι σημαντικές.
Μετρήστε την απόσταση στην εικόνα σας από τα πηγάδια σε καθεμία από τις ζώνες στη "σκάλα" και, στη συνέχεια, διαιρέστε την απόσταση με την απόσταση που διανύθηκε από το βαφή παρακολούθησης ζώνη. Αυτός ο υπολογισμός σας δίνει τη σχετική κινητικότητα κάθε ζώνης.
Παράδειγμα: Ας υποθέσουμε ότι η ζώνη παρακολούθησης βαφής ταξίδεψε 6 ίντσες και έχουμε τρεις ζώνες που ταξίδεψαν 5, 4,5 και 3,5 ίντσες.
Ποια είναι η σχετική κινητικότητά τους; Απάντηση: Διαιρούμε 5, 4.5 και 3.5 με 6 για να αποκτήσουμε σχετική κινητικότητα 0,833, 0,75 και 0,5833.
Ο κατασκευαστής σας δίνει το μέγεθος κάθε θραύσματος στις σκάλες που παρέχουν, οπότε θα πρέπει να έχετε ήδη αυτές τις πληροφορίες.
Χρησιμοποιήστε τη συνάρτηση Trendline στο πρόγραμμα υπολογιστικών φύλλων για να προσαρμόσετε μια εξίσωση στα δεδομένα. Αυτή η εξίσωση πρέπει να είναι μια εξίσωση ισχύος (π.χ. x ^ -2) και θα πρέπει να ταιριάζει στα δεδομένα σχετικά καλά (συντελεστής R τουλάχιστον 0,9). Αυτό δημιουργεί μια καμπύλη και μια τυπική καμπύλη Προέχω.
Θυμηθείτε ότι τα μικρότερα θραύσματα DNA ταξιδεύουν μακρύτερα μέσω του πηκτώματος από τα μεγάλα θραύσματα DNA, επομένως αυτά που είναι πιο κοντά στη χρωστική παρακολούθησης θα είναι τα μικρότερα. Σημειώστε, ωστόσο, ότι εάν πλασμίδιο (κυκλικό) Το DNA είναι άκοπο, θα γίνει "υπερ-κουλουριασμένο" ή στριμμένο σαν καλώδιο τηλεφώνου, πράγμα που θα το κάνει να ταξιδεύει μακρύτερα από το γραμμικό DNA του ίδιου μεγέθους.
Παρομοίως, ένα "ψευδώνυμο" πλασμίδιο που έχει αφαιρεθεί πλήρως θα ταξιδέψει κοντύτερος απόσταση από το γραμμικό DNA του ίδιου μεγέθους. Κατά συνέπεια, δεν μπορείτε να εκτιμήσετε το μέγεθος των μη κομμένων πλασμιδίων από το τζελ σας.
Ταιριάξτε τις ζώνες σε κάθε λωρίδα με την ταυτότητα του δείγματος που φορτώσατε σε αυτήν τη λωρίδα και καθορίστε αν αυτό που βλέπετε είναι αυτό που θα περίμενε κανείς. Αυτό θα εξαρτηθεί από τη φύση του πειράματός σας.
Σε γενικές γραμμές, ωστόσο, εάν αφομοιώσετε ένα ένθετο πλασμίδιο με δύο περιοριστικά ένζυμα, θα περιμένατε ότι το ένθετο θα απελευθερωθεί από το πλασμίδιο.
Δεδομένου ότι είναι πολύ μικρότερο από το πλασμίδιο, θα περίμενε κανείς να δει δύο ζώνες σε αυτήν τη λωρίδα, μία κοντά στην κορυφή και μια άλλη κάτω κοντά στον πυθμένα. Ένα πλασμίδιο που κόβεται με ένα μόνο ένζυμο περιορισμού θα πρέπει να σχηματίζει μόνο μία ζώνη που ταξιδεύει λίγο πιο μακριά από το πλασμίδιο που κόβεται με δύο ένζυμα περιορισμού, αλλά πουθενά κοντά στο ένθετο.
Μετρήστε την απόσταση από τα φρεάτια έως το κομμένο πλασμίδιο και τοποθετήστε ταινίες με το χάρακα σας. Διαιρέστε αυτούς τους αριθμούς με την απόσταση που διανύθηκε από τη βαφή παρακολούθησης για να βρείτε σχετική κινητικότητα ενθέτων και κομμένων πλασμιδίων.
