Στη μοριακή βιολογία, μπορεί να είναι καλή επιλογή ρυθμιστικού και προετοιμασία για διαφορετικά στάδια απομόνωσης DNA τη διαφορά μεταξύ μετάβασης στην πρωτεϊνική έκφραση ή ανοίγματος ενός άλλου κιτ maxi-prep για να ξεκινήσετε πάνω από. Παρά την κρίσιμη σημασία τους, οι συνταγές buffer είναι συχνά ακριβώς αυτές - συνταγές που γράφονται χωρίς εξήγηση ή αιτιολογία για τα διάφορα στοιχεία. Ένα τέτοιο ρυθμιστικό είναι το ρυθμιστικό διάλυμα γλυκόζης-tris-EDTA ή GTE.
Σε τι χρησιμοποιείται το GTE;
Το GTE χρησιμοποιείται για να επαναιωρήσει τα σφαιρίδια των βακτηριακών κυττάρων πριν από τη λύση (σπάσιμο) των κυττάρων και τη συλλογή του πλασμιδικού DNA μέσα. Η λυσοζύμη, η οποία μαλακώνει τις κυτταρικές μεμβράνες, προστίθεται συχνά μαζί με το ρυθμιστικό διάλυμα GTE. Η επίτευξη ενός ομοιογενούς εναιωρήματος ολόκληρων κυττάρων κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου έτσι ώστε το διάλυμα λύσης που προστέθηκε στη συνέχεια να μπορεί να φτάσει σε όλα τα κύτταρα είναι το κλειδί για την επίτευξη καλών αποδόσεων DNA. Το GTE έχει σχεδιαστεί για να το κάνει αυτό παρέχοντας ταυτόχρονα ένα σταθερό περιβάλλον για το DNA.
Γλυκόζη για οσμωτικότητα
50 mM (χιλιοστογραμμομοριακό) σάκχαρο γλυκόζης προστίθενται στο ρυθμιστικό διάλυμα GTE για να διατηρηθεί η οσμωτικότητα όταν η συγκέντρωση της διαλυμένης ουσίας έξω από τα κύτταρα είναι κοντά σε εκείνη εντός των κυττάρων. Αυτό αποτρέπει την πρόωρη κυτταρική λύση, η οποία μπορεί να προκαλέσει χαμηλότερες αποδόσεις DNA λόγω συσσωμάτωσης και αποικοδόμησης. Τα άλλα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος συμβάλλουν επίσης στην οσμωτικότητα του διαλύματος, αλλά η γλυκόζη, Το να είσαι μη ηλεκτρολύτης, είναι μια καλή επιλογή επειδή δεν παρεμβαίνει στο ρυθμιστικό διάλυμα της λύσης ιδιότητες.
Tris για σταθερότητα pH
Το Tris είναι το σύντομο όνομα για το τρις (υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο, το οποίο είναι ένα πολύ κοινό ρυθμιστικό pH. Στην περίπτωση ρυθμιστικού διαλύματος GTE, το όξινο άλας (Tris-HCl) προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα σε συγκέντρωση 25 mM. Αυτό διατηρεί το ρΗ του διαλύματος σε σχεδόν φυσιολογικό 8,0, ένα ιδανικό ρΗ για πρόληψη υδρόλυσης οξέος (αποικοδόμηση) του πλασμιδικού DNA και ανεπιθύμητων παρενεργειών των άλλων κυτταρικών συστατικών.
Το EDTA αποτρέπει την υποβάθμιση του DNA
Το EDTA, ή το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ, συλλαμβάνει ή "χηλικά" μεταλλικά ιόντα εκτός διαλύματος, εμποδίζοντας τα να συμμετάσχουν σε ανεπιθύμητες παρενέργειες. Στο buffer GTE, το EDTA προστίθεται στα 10 mM. Ο πρωταρχικός σκοπός του είναι στο ρυθμιστικό διάλυμα για τη συγκέντρωση ελεύθερου ψευδαργύρου, μαγνησίου και ασβεστίου, αποτρέποντας έτσι την αποικοδόμηση του DNA από ορισμένες οδούς που απαιτούν αυτά τα μέταλλα.
Μερικές σημαντικές συμβουλές
Κρατήστε το ρυθμιστικό διάλυμα GTE κρύο και κάντε το σε μικρές ποσότητες για να αποτρέψετε την ανάπτυξη ακούσιων βακτηρίων σε αυτό. Η ζάχαρη και το ελεγχόμενο pH δημιουργούν ένα εξαιρετικό μέσο ανάπτυξης. Χρησιμοποιείτε πάντα καθαρό νερό. Το νερό της βρύσης μπορεί να έχει περίσσεια μεταλλικών ιόντων από τους σωλήνες, κάτι που μπορεί να κατακλύσει την ικανότητα του EDTA να συλλάβει. Εάν υποψιάζεστε την παρουσία παρεμβατικού RNA στο δείγμα σας, προσθέστε το RNase A στα 100 μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο στο buffer GTE για να εξαλείψετε το πρόβλημα.