Τα πλεονεκτήματα της χρήσης Sticky End Enzymes

Η μοριακή κλωνοποίηση είναι μια κοινή μέθοδος βιοτεχνολογίας με την οποία κάθε μαθητής και ερευνητής πρέπει να γνωρίζει. Μοριακή κλωνοποίηση χρησιμοποιώντας έναν τύπο ενζύμου που ονομάζεται περιοριστικό ένζυμο για την αποκοπή του ανθρώπινου DNA σε θραύσματα που μπορούν στη συνέχεια να εισαχθούν στο πλασμιδικό DNA ενός βακτηριακού κυττάρου. Τα ένζυμα περιορισμού κόβουν το διπλόκλωνο DNA στα μισά. Ανάλογα με το ένζυμο περιορισμού, το κόψιμο μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα είτε κολλώδες άκρο είτε αμβλύ άκρο. Τα κολλώδη άκρα είναι πιο χρήσιμα στη μοριακή κλωνοποίηση επειδή εξασφαλίζουν ότι το ανθρώπινο θραύσμα DNA εισάγεται στο πλασμίδιο στη σωστή κατεύθυνση. Η διαδικασία απολίνωσης ή σύντηξη θραυσμάτων DNA, απαιτεί λιγότερο DNA όταν το DNA έχει κολλώδη άκρα. Τέλος, πολλά ένζυμα περιορισμού κολλώδους άκρου μπορούν να παράγουν το ίδιο κολλώδες άκρο, παρόλο που κάθε ένζυμο αναγνωρίζει διαφορετική αλληλουχία περιορισμού. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα να αποκοπεί η περιοχή ενδιαφέροντος DNA από κολλώδη άκρα.

Τα περιοριστικά ένζυμα είναι ένζυμα που κόβουν αναγνωρίζουν συγκεκριμένες αλληλουχίες σε δίκλωνο DNA και κόβουν το DNA στα μισά σε αυτήν την αλληλουχία. Η αναγνωρισμένη ακολουθία ονομάζεται τοποθεσία περιορισμού. Τα ένζυμα περιορισμού ονομάζονται ενδονουκλεάσες επειδή κόβουν το διπλόκλωνο DNA, έτσι είναι το DNA κανονικά, σε τοποθεσίες που βρίσκονται μεταξύ των άκρων του DNA. Υπάρχουν περισσότερα από 90 διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Κάθε αναγνωρίζει έναν ξεχωριστό ιστότοπο περιορισμού. Τα ένζυμα περιορισμού διασπούν τις αντίστοιχες θέσεις περιορισμού τους 5.000 φορές πιο αποτελεσματικά από άλλες τοποθεσίες που δεν αναγνωρίζουν.

Τα ένζυμα περιορισμού διατίθενται σε δύο γενικές τάξεις. Κόβουν το DNA σε κολλώδη άκρα ή αμβλύ άκρα. Ένα κολλώδες άκρο έχει μια μικρή περιοχή νουκλεοτιδίων, τα δομικά στοιχεία του DNA, που δεν είναι ζευγαρωμένα. Αυτή η μη ζευγαρωμένη περιοχή ονομάζεται προεξοχή. Η προεξοχή λέγεται ότι είναι κολλώδης επειδή θέλει και θα ζευγαρωθεί με ένα άλλο κολλώδες άκρο που έχει συμπληρωματική προεξοχή. Οι κολλώδεις άκρες είναι σαν τα δίδυμα που έχουν χαθεί πολύ και προσπαθούν να αγκαλιάζονται σφιχτά όταν συναντηθούν. Από την άλλη πλευρά, τα αμβλύ άκρα δεν είναι κολλώδη επειδή όλα τα νουκλεοτίδια είναι ήδη ζευγαρωμένα μεταξύ των δύο κλώνων του DNA. Το πλεονέκτημα των κολλών άκρων είναι ότι ένα θραύσμα ανθρώπινου DNA μπορεί να χωρέσει μόνο σε ένα βακτηριακό πλασμίδιο σε μία κατεύθυνση. Αντίθετα, εάν τόσο το ανθρώπινο DNA όσο και το βακτηριακό πλασμίδιο έχουν αμβλύ άκρα, το ανθρώπινο DNA μπορεί να εισαχθεί από το κεφάλι προς την ουρά ή από την ουρά προς το κεφάλι στο πλασμίδιο.

Αν και το DNA με άκρα ραβδιού έχει ευκολότερο χρόνο να βρει ο ένας τον άλλον λόγω της «κολλητικότητας» τους, ούτε τα κολλώδη άκρα ούτε τα αμβλύ άκρα μπορούν να συντηχθούν μαζί σε ένα συνεχές κομμάτι DNA. Ο σχηματισμός ενός συνεχούς τμήματος DNA που είναι πλήρως συνδεδεμένος απαιτεί ένα ένζυμο που ονομάζεται λιγάση. Οι λιγάσες συνδέουν τους σκελετούς των νουκλεοτιδίων στα κολλώδη ή αμβλύ άκρα, με αποτέλεσμα μια συνεχή αλυσίδα νουκλεοτιδίων. Επειδή τα κολλώδη άκρα βρίσκουν το ένα το άλλο πιο γρήγορα λόγω της έλξης μεταξύ τους, η διαδικασία σύνδεσης απαιτεί λιγότερο ανθρώπινο DNA και λιγότερο πλασμιδικό DNA. Τα αμβλεία άκρα του DNA και των πλασμιδίων είναι λιγότερο πιθανό να βρεθούν μεταξύ τους, και έτσι η σύνδεση των αμβλειών άκρων απαιτεί να τοποθετηθεί περισσότερο DNA στον δοκιμαστικό σωλήνα.

Οι θέσεις περιορισμού βρίσκονται σε ολόκληρο το γονιδίωμα των οργανισμών, αλλά δεν έχουν ομοιόμορφη απόσταση. Στα πλασμίδια, μπορούν να κατασκευαστούν ώστε να βρίσκονται ακριβώς το ένα δίπλα στο άλλο. Οι επιστήμονες που θέλουν να κόψουν ένα κομμάτι ανθρώπινου DNA από το ανθρώπινο γονιδίωμα πρέπει να βρουν θέσεις περιορισμού που βρίσκονται μπροστά και πίσω από την περιοχή του θραύσματος. Εκτός από τη διασφάλιση ότι ένα θραύσμα DNA εισάγεται στη σωστή κατεύθυνση, διαφορετικά ένζυμα κολλώδους άκρου μπορούν να δημιουργήσουν το ίδιο κολλώδες άκρο παρόλο που αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες περιορισμού. Για παράδειγμα, οι BamHI, BglII και Sau3A έχουν διαφορετικές ακολουθίες αναγνώρισης αλλά παράγουν το ίδιο κολλώδες άκρο GATC. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι θα υπάρχουν κολλώδεις περιοχές περιορισμού τελών που πλαισιώνουν το ανθρώπινο γονίδιο που σας ενδιαφέρει.