Το Tris, ή τρις (υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο, είναι ένα κοινό βιολογικό ρυθμιστικό, που χρησιμοποιείται καθ 'όλη τη διαδικασία εκχύλισης DNA. Κατά την εξαγωγή από οποιονδήποτε αριθμό πηγών, το DNA είναι ευαίσθητο στο pH. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής λύσης, την αφαίρεση των ανεπιθύμητων κυτταρικών συστατικών και την καταβύθιση, το tris χρησιμοποιείται για τη διατήρηση ενός σταθερού ρΗ. Επιπλέον, παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική λύση.
TL; DR (Πάρα πολύ καιρό; Δεν διαβάστηκε)
Η εκχύλιση DNA είναι μια διαδικασία ευαίσθητη στο ρΗ και η χρήση ρυθμιστικού διαλύματος tris βοηθά στη διατήρηση του σταθερού pH κατά την λύση και την εκχύλιση των κυττάρων.
Tris ως Buffer
Καθώς το pH μπορεί να επηρεάσει και να επηρεαστεί από έναν αριθμό κυτταρικών παραγόντων, η διατήρηση ενός σταθερού pH είναι απαραίτητη για την πειραματική επιστήμη. Τα βιολογικά ρυθμιστικά, όπως το tris, είναι σημαντικά επειδή μπορούν να διατηρήσουν ένα σταθερό pH παρά τις επιρροές που διαφορετικά θα μπορούσαν να μετατοπίσουν το pH. Η τρις (υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο, με pKa 8,1, είναι ένα αποτελεσματικό ρυθμιστικό διάλυμα μεταξύ ρΗ 7 και 9. Λόγω του ουδέτερου εύρους, το tris είναι ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο ρυθμιστικό σε βιολογικά εργαστήρια. Ωστόσο, το ρυθμιστικό διάλυμα είναι ευαίσθητο στη θερμοκρασία και πρέπει να χρησιμοποιείται στη θερμοκρασία στην οποία είχε αρχικά pH για να αποφευχθεί η ανακρίβεια.
Λύση κυττάρων
Η λύση, ή το άνοιγμα των κυττάρων, είναι το πρώτο βήμα της εξαγωγής DNA. Αυτό επιτυγχάνεται με ρυθμιστικό που περιέχει tris και EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ). Το EDTA δεσμεύει δισθενή κατιόντα όπως ασβέστιο και μαγνήσιο. Δεδομένου ότι αυτά τα ιόντα βοηθούν στη διατήρηση της ακεραιότητας της κυτταρικής μεμβράνης, η εξάλειψή τους με EDTA αποσταθεροποιεί τη μεμβράνη. Το Tris είναι το κύριο ρυθμιστικό στοιχείο. Ο κύριος ρόλος του είναι να διατηρήσει το pH του ρυθμιστικού σε σταθερό σημείο, συνήθως 8,0. Επιπλέον, tris πιθανώς αλληλεπιδρά με το LPS (λιποπολυσακχαρίτης) στη μεμβράνη, χρησιμεύοντας για την αποσταθεροποίηση της μεμβράνης περαιτέρω.
Το Tris προστατεύει το DNA από μεταβολές pH
Όταν τα κύτταρα διασπώνται, το DNA και το περιεχόμενό τους χύνονται στο ρυθμιστικό. Επιπλέον, περιλαμβάνονται συχνά η RNase Α (καταστρέφει το RNA), οι πρωτεάσες (καταστρέφει τις πρωτεΐνες) και το SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο, διαλυτοποιεί τα θραύσματα της μεμβράνης). Συνολικά, αυτή η σούπα κυτταρικών περιεχομένων και τεμαχισμένων RNA και πρωτεϊνών μπορεί να έχει μεγάλο αντίκτυπο στο pH του διαλύματος. Επειδή το DNA είναι ευαίσθητο στο pH, είναι σημαντικό για το tris να ρυθμίσει τη σούπα και να διατηρήσει το pH σε σταθερό σημείο.
Καταβύθιση DNA
Στο τελικό στάδιο της εκχύλισης DNA, το ίδιο το DNA εξάγεται από το διάλυμα. Σε αυτό το σημείο, το DNA είναι διαλυτό στο ρυθμιστικό. Για εκχύλιση από το διάλυμα, το DNA καθίσταται αδιάλυτο με προσθήκη αιθανόλης ή ισοπροπανόλης (ισοπροπυλική αλκοόλη). Όταν γίνει αυτό, το DNA γίνεται προφανές σε διάλυμα ως μια λευκή ήδη ουσία. Αν και το DNA μπορεί να απομονωθεί από τα υπόλοιπα κυτταρικά συστατικά με αυτόν τον τρόπο, δεν είναι "χρησιμοποιήσιμο" όταν είναι αδιάλυτο. Μετά την απομόνωση, η αλκοόλη απομακρύνεται και το DNA πρέπει να επιστραφεί σε ένα βιολογικό ρυθμιστικό, όπως tris, για χρήση.
Κάντο μόνος σου
Αν και η εκχύλιση του DNA γίνεται συνήθως σε ερευνητικά εργαστήρια γενικά χρησιμοποιώντας ένα από τα πολλά κιτ που διατίθενται στο εμπόριο, ο καθένας μπορεί να κάνει εξαγωγή DNA στο σπίτι χρησιμοποιώντας κοινά είδη οικιακής χρήσης και πράσινο μπιζέλια ή σπανάκι. Σε αυτήν την περίπτωση, το tris, ούτε οποιοδήποτε βιολογικό ρυθμιστικό, δεν υπάρχει για την προστασία του DNA από μεταβολές του pH. Ωστόσο, είναι ένας οπτικός τρόπος να βοηθηθούν οι μαθητές να συνδεθούν με το κυτταρικό DNA.