Πώς συλλέγεται και προετοιμάζεται ένα δείγμα DNA για μελέτη

Προτού μπορέσουν να ακολουθήσουν το DNA ή να το αλλάξουν μέσω της γενετικής μηχανικής, οι επιστήμονες πρέπει πρώτα να το απομονώσουν. Αυτό μπορεί να φαίνεται δύσκολο, καθώς τα κύτταρα περιέχουν μια μεγάλη ποικιλία άλλων ενώσεων όπως πρωτεΐνες, λίπη, σάκχαρα και μικρά μόρια. Ευτυχώς, οι βιολόγοι μπορούν να κάνουν χρήση των χημικών ιδιοτήτων του DNA για να διαχωρίσουν το DNA από αυτούς τους μολυσματικούς παράγοντες και να το προετοιμάσουν για περαιτέρω μελέτη. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται εκχύλιση DNA.

Υπάρχουν πολλές διαφορετικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση DNA. Αυτό που χρησιμοποιείται από ένα μεμονωμένο εργαστήριο εξαρτάται από τον τύπο του πειράματος που θα εκτελεστεί και από το πόσο καθαρό πρέπει να είναι το DNA. Οι επιστήμονες ξεκινούν γενικά με ένα δείγμα που περιέχει κύτταρα - ένα δείγμα ιστού ή αίματος, για παράδειγμα - και τα ανοίγουν, ή τα λύουν. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους μπορείτε να λύσετε τα κύτταρα. Η προσθήκη απορρυπαντικού θα τους προκαλέσει να διαχωριστούν, όπως επίσης και τα ηχητικά κύματα υψηλής συχνότητας. Εναλλακτικά, η ανάμιξη του δείγματος με γυάλινες χάντρες και η ταχεία δόνησή του θα σπάσει φυσικά τα κύτταρα και θα απελευθερώσει το περιεχόμενό τους.

Εάν δεν απαιτείται υψηλή καθαρότητα, οι επιστήμονες μπορούν να προσθέσουν ένα ένζυμο που ονομάζεται πρωτεϊνάση Κ για να διασπάσουν τις περισσότερες από τις πρωτεΐνες του δείγματος και στη συνέχεια να το χρησιμοποιήσουν ως έχει. Αυτή η τεχνική είναι πολύ βρώμικη, ωστόσο, δεδομένου ότι οι περισσότεροι ρύποι εξακολουθούν να υπάρχουν, οπότε είναι κατάλληλη μόνο εάν η ταχύτητα είναι προτεραιότητα και η καθαρότητα δεν αποτελεί πρόβλημα. Μια άλλη γρήγορη και βρώμικη προσέγγιση είναι να αφαιρεθούν οι πρωτεΐνες αυξάνοντας τη συγκέντρωση άλατος προσθέτοντας άλατα όπως αμμώνιο ή οξικό κάλιο για να αναγκάσουμε τις πρωτεΐνες να καθιζάνουν. Αυτή η τεχνική είναι επίσης αρκετά βρώμικη δεδομένου ότι πολλοί άλλοι μολυσματικοί παράγοντες εξακολουθούν να υπάρχουν.

Μια άλλη προσέγγιση είναι η λύση των κυττάρων με απορρυπαντικό και στη συνέχεια ανάμιξη του διαλύματος με ισοαμυλική αλκοόλη, χλωροφόρμιο και φαινόλη. Το διάλυμα στη συνέχεια διαχωρίζεται σε δύο στρώσεις. Οι πρωτεΐνες καταλήγουν στο ανώτερο οργανικό στρώμα, ενώ το DNA παραμένει στο κατώτερο υδατικό στρώμα. Αυτή η τεχνική απαιτεί προσεκτικό έλεγχο της συγκέντρωσης άλατος και του pH για καλά αποτελέσματα. Είναι χρονοβόρα και τόσο η φαινόλη όσο και το χλωροφόρμιο είναι εξαιρετικά τοξικά χημικά. Κατά συνέπεια, ενώ οι εκχυλίσεις φαινόλης-χλωροφορμίου ήταν κάποτε ρουτίνα, άλλες τεχνικές έχουν γίνει πιο δημοφιλείς τα τελευταία χρόνια.

Η χρωματογραφία ανταλλαγής ανιόντων προσφέρει υψηλότερη καθαρότητα και πιο συνεπή αποτελέσματα από την εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου. Ένας σωλήνας ή στήλη είναι γεμάτη με μικρά σωματίδια που έχουν θετικά φορτισμένες θέσεις πάνω τους όπου μπορεί να δεσμευτεί ένα αρνητικά φορτισμένο μόριο ή ανιόν. Το DNA προσδένεται σε αυτές τις θέσεις ανταλλαγής ανιόντων ενώ άλλοι μολυσματικοί παράγοντες όπως οι πρωτεΐνες και το RNA ξεπλένονται από τη στήλη. Αργότερα, ένα διάλυμα πλούσιο σε αλάτι χρησιμοποιείται για να τραβήξει το DNA από τη στήλη.

Η ταχύτερη και ίσως πιο αξιόπιστη τεχνική για τον καθαρισμό του DNA είναι η χρήση ενός ειδικά κατασκευασμένου κιτ. Αυτά τα κιτ περιέχουν μεμβράνες πυριτικής πηκτής σε ένα σωλήνα. Το DNA κολλάει στη μεμβράνη, ενώ άλλοι μολυσματικοί παράγοντες ξεπλένονται χρησιμοποιώντας μια σειρά από ειδικά παρασκευασμένα διαλύματα αλατιού που συνοδεύουν το κιτ. Τέλος, το DNA ξεπλένεται από τη στήλη με διάλυμα χαμηλού άλατος. Αυτά τα κιτ είναι γρήγορα, εύχρηστα και προσφέρουν αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.

Μόλις το DNA απομονωθεί και επαναιωρηθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα ρυθμισμένου με ρΗ, το τελευταίο βήμα είναι να ελεγχθεί η καθαρότητά του. Ένας εύκολος και βολικός τρόπος να το κάνετε είναι να ελέγξετε πόση υπεριώδης ακτινοβολία απορροφά στα μήκη κύματος των 260 και 280 νανομέτρων. Η απορρόφηση στα 260 νανόμετρα διαιρούμενη με απορρόφηση στα 280 νανόμετρα πρέπει να ισούται με 1,8 εάν το DNA είναι καθαρό. Η μέτρηση της απορρόφησης στα 260 νανόμετρα σας επιτρέπει επίσης να προσδιορίσετε τη συγκέντρωση του DNA.