Τα μειονεκτήματα του Western Blotting

Η κηλίδα Western είναι μία από τις πιο κοινές διαδικασίες στα βιοχημικά εργαστήρια. Βασικά, διαχωρίζει τις πρωτεΐνες από ένα δείγμα κατά μέγεθος, και στη συνέχεια δοκιμάζει χρησιμοποιώντας αντισώματα για να προσδιορίσει εάν υπάρχει μια δεδομένη πρωτεΐνη. Είναι χρήσιμο όχι μόνο στην έρευνα αλλά και σε ιατρικά ή διαγνωστικά εργαστήρια. Οι δοκιμές τόσο για τον ιό HIV όσο και για τη νόσο του Lyme, για παράδειγμα, περιλαμβάνουν μια δοκιμασία ανοσοπροσροφητικής σύνδεσης με ένζυμο (ELISA), ακολουθούμενη από μια κηλίδα Western εάν η ELISA εξετάζει θετικά. Παρά τη δημοτικότητά του, ωστόσο, το Western blotting έχει πολλά μειονεκτήματα.

Οι κλασικές κηλίδες Western δεν είναι ποσοτικές. Με άλλα λόγια, ενώ μπορούν να ενημερώσουν τους ερευνητές εάν υπάρχει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη, δεν καθιστούν δυνατή την ποσοτικοποίηση της ποσότητας της πρωτεΐνης. Ορισμένες εταιρείες βιοτεχνολογίας πωλούν τώρα κιτ που επιτρέπουν σε ερευνητές ή τεχνικούς εργαστηρίων να ποσοτικοποιήσουν το ποσό πρωτεΐνη που υπάρχει χρησιμοποιώντας μια τυπική καμπύλη - αλλά αυτό λειτουργεί μόνο εάν είναι καθαρά δείγματα της ίδιας πρωτεΐνης διαθέσιμος. Επιπλέον, το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης μπορεί να εκτιμηθεί μόνο με στύπωμα Western, παρά να προσδιοριστεί ακριβώς όπως με τη φασματομετρία μάζας.

Ένα στύπωμα Western μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο εάν είναι διαθέσιμα πρωτογενή αντισώματα κατά της πρωτεΐνης που ενδιαφέρουν. Ενώ τα αντισώματα για πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες διατίθενται από εταιρείες βιοτεχνολογίας, δεν είναι φθηνά. Εάν τα πρωτογενή αντισώματα δεν είναι διαθέσιμα για μια δεδομένη πρωτεΐνη, δεν θα είναι δυνατό να εκτελεστεί μια κηλίδα Western αναζητώντας τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Επιπλέον, οι ερευνητές μπορεί να θέλουν να προσδιορίσουν εάν μια πρωτεΐνη έχει τροποποιηθεί κατά κάποιο τρόπο - εάν έχει φωσφορυλιωθεί (είχε φωσφορική ομάδα που συνδέεται με αυτήν), για παράδειγμα - και με την τεχνική στύπωσης Western χρειάζονται αντισώματα ειδικά για το τροποποιημένο πρωτεΐνη.

Μπορεί να είναι δύσκολο να εκτελέσετε σωστά μια κηλίδα Western και να έχετε καλά αποτελέσματα, επομένως το προσωπικό πρέπει να είναι καλά εκπαιδευμένο. Σε αυτό όπως και σε πολλά άλλα, η εμπειρία είναι ίσως ο καλύτερος δάσκαλος. Ακόμα και για έναν έμπειρο τεχνικό, ωστόσο, μια κηλίδα Western είναι χρονοβόρα. Το τμήμα ηλεκτροφόρησης γέλης του πειράματος, για παράδειγμα, θα διαρκέσει συνήθως από μία έως δύο ώρες για να τρέξει. Άλλα καθήκοντα μπορούν να εκτελεστούν ενώ το gel λειτουργεί, φυσικά, αλλά το πείραμα χρειάζεται ακόμα αρκετό χρόνο για να πάρει αποτελέσματα.

Τα αντισώματα μπορεί μερικές φορές να παρουσιάζουν κάποια σύνδεση εκτός στόχου, η οποία μπορεί να έχει φτωχότερα αποτελέσματα. Επιπλέον, με το στύπωμα Western, χρησιμοποιείτε ένα αντίσωμα κατά μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, επομένως τα αποτελέσματά σας θα σας πουν μόνο εάν υπήρχε αυτή η πρωτεΐνη. Αντίθετα, η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης αποκαλύπτει όλες τις πρωτεΐνες που υπάρχουν σε ένα δείγμα και σε αντίθεση με την κλασική κηλίδα Western είναι ποσοτική. Είναι σημαντικό να θυμόμαστε, φυσικά, ότι η φασματομετρία μάζας είναι πολύ πιο ακριβή και επίσης πιο τεχνικά δύσκολη στη χρήση σε σύγκριση με το στύπωμα Western.