Πώς οπτικοποιείται το DNA χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης;

Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι μια τεχνική που επιτρέπει στο DNA να αναλυθεί στο επίπεδο των συστατικών του μορίων. Σε αυτήν τη μέθοδο οπτικοποίησης DNA, τα δείγματα τοποθετούνται σε μέσο γέλης αγαρόζης και ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται στο πήκτωμα. Αυτό προκαλεί θραύσματα DNA να μεταναστεύσουν μέσω του πηκτώματος σε διαφορετικούς ρυθμούς σύμφωνα με τις ηλεκτροχημικές τους ιδιότητες.

Βρωμιούχο αιθίδιο

Για αυτήν την τεχνική οπτικοποίησης, το βρωμιούχο αιθίδιο αναμιγνύεται με σκόνη αγαρόζης, ρυθμιστικό EDTA και νερό για σχηματισμό της μήτρας πηκτής πριν από την ηλεκτροφόρηση. Ως αποτέλεσμα, τα μόρια βρωμιούχου αιθιδίου διασπείρονται ομοιόμορφα σε όλη τη μήτρα. Μόλις γεμίσουν τα φρεάτια του πηκτώματος με τα αντίστοιχα δείγματα DNA και τις βαφές παρακολούθησης, εφαρμόζεται τάση για να τραβήξει αργά τις μεγάλες, πολικές ενώσεις κατά μήκος της μήτρας.

Κατά τη διάρκεια αυτής της κίνησης, οι βάσεις των μορίων DNA συνδέονται προσωρινά με τα σωματίδια χάρη στο φορτίο βρωμιούχου αιθιδίου, σύροντάς τα μαζί. Όταν ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση της γέλης, κάθε μόριο DNA έχει παραλάβει σε σημαντική ποσότητα βρωμιούχου αιθιδίου.

Παρουσία υπεριώδους φωτός, το βρωμιούχο αιθίδιο εμφανίζει φθορισμό. Οι τεχνικοί λάμπουν ένα ειδικά βαθμονομημένο υπεριώδες φως σε όλη τη γέλη, ενώ μια μηχανή αποτυπώνει την εικόνα των λαμπερών θραυσμάτων.

Μπλε μεθυλενίου

Εάν δεν υπάρχει διαθέσιμος ή πρακτικός υπεριώδης ακτινοβολέας UV, οι τεχνικοί μπορούν να καταστήσουν το DNA ορατό υπό κανονικές συνθήκες με εμβάπτιση της τελικής γέλης αγαρόζης, με ηλεκτροφόρηση DNA μέσα, σε διάλυμα μπλε μεθυλενίου όλη τη νύκτα.

Ένα χλωριούχο άλας με ένα σημαντικά υδρόφοβο ανιόν, μεθυλενικά μπλε μόρια διαπερνούν ολόκληρη τη μήτρα πηκτής. Ωστόσο, η σύνδεση υδρογόνου σε όλο το DNA προκαλεί τη συσσώρευση των μορίων λεκέδων. Αυτή η αυξημένη πυκνότητα λεκέδων DNA αποδίδει μια βαθύτερη απόχρωση του μπλε, ορατή με γυμνό μάτι.

Παρακολούθηση βαφών

Πέρα από το σχετικό μέγεθος των ταινιών DNA, οι τεχνικοί μπορούν να μετρήσουν το απόλυτο μέγεθος (σε ζεύγη βάσεων) κάθε θραύσματος χρησιμοποιώντας χημικές ουσίες που ονομάζονται βαφές παρακολούθησης. Ορατό χωρίς την προσθήκη κυανού μεθυλενίου ή βρωμιούχου αιθιδίου, βαφές παρακολούθησης όπως το μπλε της βρωμοφαινόλης και η κυανόλη ξυλενίου κινούνται κατά μήκος του μήτρες πηκτής αραζόζης κατά την ηλεκτροφόρηση με την ίδια ταχύτητα με θραύσματα DNA που αποτελούνται από 300 νουκλεοτίδια και 4.000 νουκλεοτίδια, αντίστοιχα. Στην ηλεκτροφόρηση, πιο ογκώδη θραύσματα DNA ταξιδεύουν διαμέσου της μήτρας πηκτής με βραδύτερη ταχύτητα από μικρότερα θραύσματα. Επομένως, ενώ οι βαφές παρακολούθησης δεν επηρεάζουν άμεσα την ορατότητα των θραυσμάτων DNA, συγκρίνοντας τη θέση ενός θραύσματος DNA στη γέλη στη θέση αυτών των χρωμάτων επιτρέπουν στους τεχνικούς να "βλέπουν" τον κατά προσέγγιση αριθμό νουκλεοτιδίων του θραύσματος DNA περιέχει.

  • Μερίδιο
instagram viewer