Όταν εργάζεστε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), η καλή βαθμονόμηση είναι απολύτως απαραίτητη για την εξασφάλιση αξιόπιστων και ποιοτικών αποτελεσμάτων. Η σωστή βαθμονόμηση ενός οργάνου HPLC ξεκινά με τη δημιουργία ενός κατάλληλου προτύπου βαθμονόμησης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η βαθμονόμηση απαιτεί στην πραγματικότητα μια σειρά προτύπων αυξανόμενης συγκέντρωσης προκειμένου να παραχθεί αυτό που είναι γνωστό ως καμπύλη βαθμονόμησης. Αυτή είναι μια γραφική γραμμή και μια σχετική εξίσωση που περιγράφει τη σχέση μεταξύ της συγκέντρωσης της χημικής ουσίας που εξετάζεται και της απόκρισης του ανιχνευτή HPLC.
Προσδιορίστε τη χημική ουσία που θέλετε να δοκιμάσετε για τη χρήση του HPLC (ο "αναλύτης"). Για παράδειγμα, ίσως θελήσετε να δοκιμάσετε μια σειρά αναψυκτικών για περιεκτικότητα σε φρουκτόζη, οπότε η φρουκτόζη θα ήταν η αναλυόμενη ουσία.
Λάβετε μια ποσότητα της αναλυόμενης χημικής ουσίας κατάλληλης καθαρότητας. Κανονικά η καθαρότητα πρέπει να είναι πάνω από 99% και η αναλυόμενη ουσία πρέπει να αγοραστεί από μια αξιόπιστη εταιρεία παροχής χημικών. Στην περίπτωση της φρουκτόζης, για παράδειγμα, θα αγοράζετε καθαρή φρουκτόζη από έναν πωλητή χημικών και όχι από ένα μανάβικο.
Προσδιορίστε τις μέγιστες και ελάχιστες αναμενόμενες συγκεντρώσεις του αναλύτη στα δείγματα που σκοπεύετε να δοκιμάσετε στο HPLC. Στην περίπτωση αναψυκτικών, εξετάζετε τις ετικέτες των ποτών και προσδιορίζετε τη χαμηλότερη και υψηλότερη περιεκτικότητα σε φρουκτόζη μεταξύ των ποτών που θα δοκιμάσετε. Λάβετε υπόψη ότι το αρχικό δείγμα (το αναψυκτικό) μπορεί να αραιωθεί ή να υποστεί αλλιώς χειρισμό κατά την προετοιμασία για ανάλυση (ανάλογα με τη μέθοδο HPLC που χρησιμοποιείται) και έτσι μπορεί να είναι η συγκέντρωση του αναλύτη στα δείγματα που εγχύθηκαν πραγματικά στο HPLC τροποποιήθηκε. Πρέπει να ληφθεί υπόψη η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στα δείγματα που εκτελούνται στο HPLC.
Προσδιορίστε τον διαλύτη στον οποίο θα διαλύσετε τον αναλύτη σας για να συνθέσετε τα πρότυπα βαθμονόμησης. Αυτός ο διαλύτης πρέπει να μπορεί να διαλύει σωστά τον αναλύτη σε σχετικά μεγάλο εύρος συγκέντρωσης (τουλάχιστον τόσο υψηλό όσο στα δείγματα που σκοπεύετε να δοκιμάσετε). Επίσης, αυτός ο διαλύτης θα πρέπει ιδανικά να είναι παρόμοιος με την «κινητή φάση:» ο διαλύτης που χρησιμοποιείται για τη μεταφορά δειγμάτων μέσω του οργάνου HPLC.
Υπολογίστε την ποσότητα της αναλυόμενης ουσίας που απαιτείται για να δημιουργήσετε μια λύση "βασικού αποθέματος" του αναλύτη. Αυτό διαπιστώνεται πολλαπλασιάζοντας την απαιτούμενη συγκέντρωση του προτύπου αποθεμάτων με τον επιθυμητό όγκο. Η συγκέντρωση του αναλύτη σε αυτό το διάλυμα θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 10% υψηλότερη από την υψηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση δείγματος. Εάν η υψηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση φρουκτόζης σε δείγμα αναψυκτικών είναι 8 γραμμάρια / 100 χιλιοστόλιτρα, τότε το πρότυπο του αποθέματος θα μπορούσε να γίνει σε συγκέντρωση 10 γραμμάρια φρουκτόζης / 100 χιλιοστόλιτρα. Ένας λογικός όγκος είναι 500 χιλιοστόλιτρα, επομένως απαιτούνται 8/100 ml x 500 ml = 40 γραμμάρια φρουκτόζης.
Ζυγίστε την απαιτούμενη ποσότητα αναλυόμενης ουσίας σε κατάλληλο επίπεδο ακρίβειας. Συχνά είναι κατάλληλη μια τιμή βάρους σε γραμμάρια ακριβείας έως ένα ή δύο δεκαδικά ψηφία, αλλά μπορεί να απαιτείται περισσότερη ακρίβεια για ορισμένες μεθόδους.
Μεταφέρετε τη ζυγισμένη αναλυόμενη ουσία σε μια ογκομετρική φιάλη του απαραίτητου όγκου και προσθέστε τον επιθυμητό διαλύτη στο σημάδι πλήρωσης στη φιάλη. Η χρήση ογκομετρικής φιάλης (αντί για ογκομετρικό ποτήρι, για παράδειγμα) αυξάνει την ακρίβεια της τυπικής τιμής συγκέντρωσης του αποθέματος. Βεβαιωθείτε ότι όλη η αναλυόμενη ουσία μεταφέρεται στη φιάλη. χρησιμοποιήστε μέρος του διαλύτη για να το πλύνετε, εάν είναι απαραίτητο.
Κάντε μια σειρά από διάφορες αραιώσεις του προτύπου αποθεμάτων, μεταφέροντας γνωστούς όγκους του προτύπου αποθεμάτων σε ογκομετρικές φιάλες, χρησιμοποιώντας πιπέτες για ακριβή μεταφορά και προσθέτοντας διαλύτη. Η χαμηλότερη τυπική συγκέντρωση πρέπει να είναι κάτω από το χαμηλότερο αναμενόμενο δείγμα προς ανάλυση. Στο παράδειγμα αναψυκτικών, εάν η χαμηλότερη αναμενόμενη συγκέντρωση φρουκτόζης σε ένα δείγμα είναι 2 γραμμάρια / 100 ml, τότε θα μπορούσε να γίνει πρότυπο 1 γραμμαρίου / 100 ml. Αυτό θα μπορούσε να γίνει με μια δεκαπλάσια αραίωση του προτύπου αποθεμάτων. Η τυπική σειρά θα πρέπει να περιλαμβάνει συνολικά 5 ή 6 συγκεντρώσεις, οπότε απαιτούνται πρόσθετες αραιώσεις για την παραγωγή προτύπων 3, 5 και 8 γραμμαρίων φρουκτόζης / ml. Τώρα έχετε μια σειρά τυπικών λύσεων με τις οποίες μπορείτε να βαθμονομήσετε το HPLC.