Η ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) είναι μια βιοχημική μέθοδος ταυτοποίησης πρωτεϊνών σε διάλυμα. Όπως απεικονίζεται από τους Mathews et al στο "Biochemistry", τα δείγματα πρωτεϊνών φορτώνονται πρώτα σε "φρεάτια" ή οπές στο ένα άκρο του μπλοκ πηκτής πολυακρυλαμιδίου. Στη συνέχεια εφαρμόζεται ένα ηλεκτρικό πεδίο στο πήκτωμα. Το SDS, που προστίθεται στα φορτωμένα δείγματα, αναιρεί το φυσικό φορτίο των πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό, το μοριακό βάρος πρωτεΐνης καθορίζει μόνο την ταχύτητα μετανάστευσης των πρωτεϊνών καθώς κινούνται μέσω του πηκτώματος προς τον θετικά φορτισμένο πόλο, σημειώνει η Bitesize Bio. Πολλαπλές πρωτεΐνες στο ίδιο δείγμα, επομένως, χωρίζονται μεταξύ τους και μεταναστεύουν σε διαφορετικές θέσεις.
Προσανατολίστε τη φωτογραφία του τζελ. "Κορυφή" είναι η θέση των πηγαδιών όπου τα δείγματα προστέθηκαν αρχικά. "Κάτω" είναι το σημείο όπου τα δείγματα μετανάστευσαν προς και συνήθως περιέχει το μπροστινό μέρος της βαφής που δείχνει το μπροστινό μέρος των δειγμάτων. Είτε το αριστερό είτε το δεξί πρέπει να περιέχει ένα "δείκτη", που χρησιμοποιείται ως προβλέψιμος οδηγός μοριακού βάρους.
Επισημάνετε τα δείγματα για κάθε λωρίδα. Σε όλη την κορυφή, τα δείγματα που προστέθηκαν στα φρεάτια θα έχουν μεταναστεύσει κάθετα σε "λωρίδες". Επομένως, όλες οι μπάρες που είναι ορατές σε κάθετη στήλη προήλθαν από ένα δείγμα που φορτώθηκε ακριβώς πάνω από αυτό. Χρησιμοποιήστε το χάρακα και το στυλό για να βάλετε περιγράμματα στις λωρίδες, εάν είναι δύσκολο να απεικονίσετε στήλες.
Επισημάνετε τα μοριακά μεγέθη των ζωνών στη λωρίδα δείκτη. Οι δείκτες που διατίθενται στο εμπόριο συνοδεύονται από μια εικόνα του μοτίβου της ζώνης, καθώς και τα μοριακά βάρη κάθε ζώνης. Οι ζώνες είναι οι σκοτεινές οριζόντιες "ράβδους", οι οποίες είναι πραγματικά χρωματισμένες πρωτεΐνες που είναι ενσωματωμένες στο πήκτωμα.
Σχεδιάστε ελαφριές οριζόντιες γραμμές που εκτείνονται από κάθε ζώνη σήμανσης στο αντίθετο άκρο της γέλης. Προσέξτε να κάνετε αυτές τις γραμμές παράλληλες με τα φρεάτια και προς το μέτωπο της βαφής. Αυτές οι γραμμές υποδεικνύουν πού θα εντοπίζονταν πρωτεΐνες του μοριακού βάρους που υποδεικνύονταν από κάθε μία από τις ζώνες σήμανσης σε κάθε λωρίδα. Για παράδειγμα, μια ζώνη στη λωρίδα 4 που βρίσκεται ακριβώς κάτω από τη γραμμή που εκτείνεται από το 25-kilodalton η ζώνη σήμανσης θα υποδηλώνει ότι η λωρίδα λωρίδας 4 έχει σχεδόν αλλά όχι αρκετά 25 κιλοδαλτόνια σε μοριακό βάρος.
Επισημάνετε κάθε ζώνη σε κάθε λωρίδα με το εκτιμώμενο μοριακό βάρος της. Χρησιμοποιήστε τους δείκτες ως οδηγό και εκτιμήστε τις τιμές μεταξύ των μεγεθών των δεικτών.
Κάτω από τη φωτογραφία γέλης, δημιουργήστε μια λίστα με "πρωτεΐνες" για κάθε λωρίδα. Ξεκινήστε δηλώνοντας τι είναι γνωστό για κάθε δείγμα, όπως η προέλευση ή οι συνθήκες. Στη συνέχεια, απαριθμήστε το εκτιμώμενο μοριακό βάρος κάθε ζώνης στη λωρίδα. Οι λωρίδες με μία ταινία υποδεικνύουν ότι το δείγμα περιέχει μόνο μία πρωτεΐνη. Οι λωρίδες με πολλαπλές ζώνες υποδεικνύουν την παρουσία πολλαπλών πρωτεϊνών. Οι ζώνες που τρέχουν με το μέτωπο μετεγκατάστασης είναι μικρότερες από τις προτεινόμενες από τον πλησιέστερο δείκτη και πιθανότατα δεν μπορούν να προβλεφθούν παρά μόνο ως "μικρότερες από" που δείχνει ο δείκτης.
Στον κατάλογο πρωτεϊνών, σημειώστε τις παραδοχές. Η εμφάνιση «κηλίδας» μπορεί να υποδηλώνει ότι υπάρχουν πάρα πολλές πρωτεΐνες ή ότι το ιξώδες του δείγματος επηρέασε τη μετανάστευσή του Εάν οι ζώνες φαίνεται να υπερβαίνουν το άκρη της λωρίδας ή είναι αρκετά μεγάλη σε σύγκριση με άλλες ζώνες, τότε η συγκέντρωση αυτής της πρωτεΐνης είναι πιθανώς πολύ υψηλή και θα πρέπει να αραιωθεί στο μέλλον ηλεκτροφόρηση. Μια γκριζωπή απόχρωση σε όλη τη λωρίδα, πιο σκούρα από το χρώμα του πηκτώματος φόντου, υποδηλώνει διακριτά θραύσματα πρωτεΐνης.
Προσδιορίστε την ταυτότητα των πρωτεϊνών σε κάθε λωρίδα. Αν και αυτό γίνεται χρησιμοποιώντας μόνο μοριακό βάρος, η πηγή κάθε λωρίδας πιθανότατα δείχνει ενδείξεις επίσης. Λάβετε υπόψη ότι υπό ορισμένες συνθήκες, οι πρωτεΐνες μπορούν να διατηρήσουν μια διμερή ή τριμερή σχέση σε ένα πήκτωμα. Επομένως, μία πρωτεΐνη μπορεί να εμφανιστεί σε ένα πήκτωμα ως τρεις διαφορετικές ζώνες. Ακόμα και αν δεν είναι δυνατή η αναγνώριση πρωτεϊνών, το σχετικό σκοτάδι των ζωνών μπορεί να συνεπάγεται τις συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών σε διάλυμα. Οποιαδήποτε περίεργη και άγνωστη πρωτεΐνη μπορεί να απομονωθεί απευθείας από το αρχικό πήκτωμα και να σταλεί για αναγνώριση.
Πράγματα που θα χρειαστείτε
- Φωτογραφία πηκτής SDS-PAGE, χρωματισμένη
- Χρησιμοποιείται κλειδί για δείκτη μοριακού βάρους
- Κυβερνήτης
- Στυλό