Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι μια εργαστηριακή τεχνική που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό και τον προσδιορισμό των ενώσεων. Είναι ένας τύπος χρωματογραφίας στήλης που βασίζεται σε διαφορετικές πολικότητες ενώσεων σε ένα διάλυμα για να τις διαχωρίσει. Η HPLC διαφέρει από την τυπική χρωματογραφία στήλης επειδή χρησιμοποιεί πίεση για να πιέσει το διάλυμα μέσω της στήλης πιο γρήγορα, και επομένως παράγει ταχύτερα, και μερικές φορές πιο ακριβή, αποτελέσματα. Ο στόχος είναι ο διαχωρισμός ενώσεων στη στήλη και η έξοδος τους ξεχωριστά.
Λόγω της ταχύτητας της HPLC και εξαρτάται από διαφορετικές πολικότητες ενώσεων, δύο ενώσεις με παρόμοια δομή και πολικότητες μπορούν να εξέλθουν από τη συσκευή χρωματογραφίας ταυτόχρονα ή σχεδόν την ίδια χρόνος. Αυτό είναι γνωστό ως συνασπισμός. Η συνένωση καθιστά τον προσδιορισμό ακριβώς ποιο τμήμα του μείγματος εκλούεται σε σημείο δύσκολο.
Η HPLC χρησιμοποιεί συνήθως μια γυάλινη στήλη γεμάτη με χάντρες κατασκευασμένες από διαφορετικά υλικά. Τα μίγματα που πιέζονται μέσω της στήλης έχουν χημικές ουσίες που συνδέονται με διαφορετικές αντοχές στις χάντρες. Η ισχύς της δέσμευσης, η οποία εξαρτάται από την ομοιότητα της πολικότητας, καθορίζει πόσο καιρό το χημικό θα συνδεθεί με το σφαιρίδιο πριν απελευθερωθεί. Ορισμένες ενώσεις δεσμεύονται τόσο έντονα ώστε ουσιαστικά δεν απελευθερώνονται ποτέ από τα σφαιρίδια στη στήλη και δεν μετριούνται ποτέ στο διάλυμα που εξέρχεται από τη στήλη.
Οι τυπικές τεχνικές εργαστηριακού διαχωρισμού περιλαμβάνουν την ανάπτυξη μιας ανάλυσης ή μεθόδου διαχωρισμού και στη συνέχεια την εφαρμογή αυτής της ανάλυσης για τον διαχωρισμό μεμονωμένων ενώσεων από ένα διάλυμα. Ωστόσο, αυτό συνήθως οδηγεί σε πολλαπλές λύσεις που πρέπει επίσης να υποβληθούν σε διαδικασίες, οδηγώντας σε εκθετική αύξηση της πολυπλοκότητας. Αν και το HPLC μπορεί συχνά να απλοποιήσει και να επιταχύνει αυτήν τη διαδικασία, το κόστος ανάπτυξης μιας συσκευής HPLC μπορεί να γίνει τεράστιο. Η ανάπτυξη συσκευής HPLC, αν και πολύ πιο αποτελεσματική, είναι πολύ πιο δαπανηρή από την ανάπτυξη άλλων προσδιορισμών για το διαχωρισμό των ενώσεων. Αυτό δεν το καθιστά οικονομικά βιώσιμο για πολλά μικρά ιδιωτικά εργαστήρια.
Η HPLC δεν χρησιμοποιείται μόνο για τον διαχωρισμό απλών ενώσεων, αλλά επίσης χρησιμοποιείται για την απομόνωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών από ένα κυτταρικό μείγμα. Σε αυτήν την περίπτωση, τα σφαιρίδια στη στήλη συνήθως επικαλύπτονται με ένα αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη που πρέπει να συλλέξετε. Οι πρωτεΐνες δεσμεύουν τα αντισώματα και το υπόλοιπο διάλυμα διέρχεται μέσω της στήλης, και στη συνέχεια οι πρωτεΐνες απελευθερώνονται χρησιμοποιώντας ένα άλλο διάλυμα και συλλέγονται. Αυτό απαιτεί έναν εξειδικευμένο τεχνικό να παρακολουθεί τη στήλη ανά πάσα στιγμή και να διασφαλίζει ότι η διαδικασία εκτελείται ακριβώς όπως είχε προγραμματιστεί.
