Βασικά συστατικά μιας HPLC

Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι μια τεχνική για την εργαστηριακή ανάλυση ενός μείγματος. Είναι ένας αποτελεσματικός τύπος χρωματογραφίας που χρησιμοποιεί υψηλή πίεση, και όχι απλώς βαρύτητα, για να ωθήσει ένα δείγμα ενός μείγματος μέσω μιας στήλης. Ένα δείγμα εγχύεται, και στη συνέχεια μια αντλία που περιέχει υψηλές ποσότητες πίεσης βοηθά στη μετακίνηση του δείγματος κατά μήκος μιας συσκευασμένης στήλης, όπου διαχωρίζεται σε μεμονωμένα συστατικά. Αυτός ο διαχωρισμός στη συνέχεια αναλύεται από έναν ανιχνευτή για να δώσει αποτελέσματα.

Προκειμένου να εγχυθεί σε HPLC, ένα δείγμα πρέπει πρώτα να διαλυθεί σε πολικό υγρό διαλύτη, κατά προτίμηση σε ένα με γνωστά φάσματα HPLC έτσι ώστε τα δεδομένα του να μπορούν να διακριθούν από τα δείγματα. Το υγρό διάλυμα που περιέχει το δείγμα τοποθετείται στο όργανο και αποστέλλεται στη στήλη. Η πραγματική τοποθεσία του τόπου ένεσης εξαρτάται από τη μάρκα των οργάνων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η διαδικασία ένεσης είναι αυτοματοποιημένη, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις ένας εργαζόμενος στο εργαστήριο πρέπει να εγχύσει το δείγμα χρησιμοποιώντας μια μικρή βελόνα σύριγγας.

Το εξάρτημα αντλίας της μονάδας HPLC είναι απαραίτητο επειδή παρέχει την πίεση που ωθεί το δείγμα μέσω της στήλης. Η ισχύς της αντλίας ποικίλλει, αλλά μια ισχυρή μπορεί να παράγει πίεση έως 6.000 psi ή λίβρες ανά τετραγωνική ίντσα, η οποία εφαρμόζεται μετά την έγχυση του δείγματος. Αυτό επιτρέπει στο δείγμα να περάσει από τη στήλη πιο γρήγορα και αποτελεσματικά από ό, τι εάν έπρεπε να στάζει χρησιμοποιώντας μόνο τη δύναμη της βαρύτητας.

Η αυξημένη ταχύτητα ενός δείγματος που διέρχεται μέσω της στήλης από μια αντλία επιτρέπει τη χρήση ενός διαφορετικού τύπου στήλης από εκείνο που χρησιμοποιείται σε απλή υγρή χρωματογραφία. Το υλικό συσκευασίας στη στήλη μπορεί να έχει πολύ μικρότερο μέγεθος σωματιδίων, το οποίο αυξάνει την επιφάνεια και επομένως βοηθά τις αλληλεπιδράσεις του δείγματος με τη στήλη. Οι περισσότερες στήλες HPLC λειτουργούν με πολικότητα. Το δείγμα διαλύεται σε πολικό διαλύτη και η στήλη αποτελείται από σε μεγάλο βαθμό μη πολικούς υδρογονάνθρακες. Τα πολικά μέρη του μορίου δείγματος περνούν γρήγορα από τη στήλη επειδή αλληλεπιδρούν κυρίως με το διαλύτη, ενώ τα μη πολικά συστατικά του δείγματος παραμένουν στη στήλη, σχηματίζοντας αδύναμες αλληλεπιδράσεις με τη στήλη συστατικά. Επομένως, τα συστατικά του δείγματος βγαίνουν από τη στήλη με σειρά από τα περισσότερα πολικά έως τα περισσότερα μη-πολικά.

Οι ανιχνευτές ποικίλλουν επίσης ανάλογα με τον τύπο του οργάνου HPLC που χρησιμοποιείται. Ωστόσο, τα περισσότερα λειτουργούν με τον ίδιο βασικό τρόπο. Μια πηγή υπεριώδους φωτός λάμπει στα διαχωρισμένα συστατικά του δείγματος καθώς βγαίνουν από τη στήλη. Οι περισσότερες οργανικές ενώσεις απορροφούν μια ορισμένη ποσότητα φωτός, έτσι ώστε να περνούν από την εφαρμοζόμενη δέσμη φωτός, ένας ανιχνευτής μπορεί να πάρει πόσο απορροφάται το φως. Ο ανιχνευτής καταγράφει επίσης το χρόνο συγκράτησης των συστατικών με βάση τη σειρά με την οποία βγαίνουν από τη στήλη. Αυτή η έξοδος μπορεί στη συνέχεια να αναλυθεί με βάση την περιοχή αιχμής για να προσδιοριστεί η ακριβής φύση των συστατικών του δείγματος.