Bei der Gelelektrophorese werden DNA- oder Proteinproben getrennt – typischerweise basierend auf der Größe – durch Anlegen eines elektrischen Felds, das sie durch ein Gel wandern lässt. Der Einsatz der Gelelektrophorese ist Routine in biomedizinischen Forschungslabors und wird verwendet, um eine Vielzahl unterschiedlicher Fragen zu beantworten, sodass es keine wirklich universelle Methode zur Analyse der Ergebnisse gibt.
Verschiedene Techniken wie Western-Blotting, Northern-Blotting und Southern-Blotting zum Beispiel beinhalten alle Gelelektrophorese.
Wenn du tust Agarosegel Elektrophorese von DNA-Proben, der gebräuchlichsten Art von Verfahren, müssen Sie normalerweise mindestens zwei Dinge tun: 1) Ungeschnittenes unterscheiden Plasmide aus Inserts, Nicked-Plasmiden und geschnittenen Plasmiden und 2) schätzen die Größe der verschiedenen DNA-Fragmente mit einer Standardkurve Excel oder Taschenrechner.
Sehen Sie in Ihrem Labornotizbuch nach, welche Proben in welche Spuren geladen wurden. Wenn Sie die Wells für Ihr Gel geladen haben, sollten Sie die Identität jeder Spur/Probe notiert haben.
Messen Sie mit einem Lineal den Abstand von den Vertiefungen zum Tracking-Farbstoff auf Ihrem Bild weiter gereist sind als irgendeines der DNA-Banden (mit anderen Worten, es befindet sich am unteren Ende des Gel). Notieren Sie diese Zahl – die von Ihnen verwendeten Einheiten sind nicht wichtig.
Messen Sie auf Ihrem Bild die Entfernung von den Vertiefungen zu jedem der Bänder in der "Leiter" und teilen Sie diese Entfernung dann durch die von der by zurückgelegte Entfernung Tracking-Farbstoff Band. Diese Berechnung gibt Ihnen die relative Mobilität jedes Bandes.
Beispiel: Angenommen, das Tracking-Farbband hat eine Länge von 6 Zoll und wir haben drei Bänder mit einer Länge von 5, 4,5 und 3,5 Zoll.
Wie ist ihre relative Mobilität? Antwort: Wir teilen 5, 4,5 und 3,5 durch 6, um relative Beweglichkeiten von 0,833, 0,75 und 0,5833 zu erhalten.
Der Hersteller gibt Ihnen die Größe jedes Fragments in den von ihm gelieferten Leitern an, daher sollten Sie diese Informationen bereits haben.
Verwenden Sie die Trendlinienfunktion Ihres Tabellenkalkulationsprogramms, um eine Gleichung an die Daten anzupassen. Diese Gleichung sollte eine Potenzgleichung sein (z. B. x^-2) und sollte relativ gut zu den Daten passen (R-Koeffizient von mindestens 0,9). Dadurch entsteht eine Kurve und eine Standardkurve Excel.
Denken Sie daran, dass kleinere DNA-Fragmente weiter durch das Gel wandern als große DNA-Fragmente, sodass diejenigen, die dem Tracking-Farbstoff am nächsten sind, die kleinsten sind. Beachten Sie jedoch, dass wenn Plasmid (kreisförmige) DNA ist ungeschnitten, sie wird "supercoiled" oder wie ein Telefonkabel verdreht, wodurch sie tatsächlich reist weiter als lineare DNA der gleichen Größe.
Ebenso wandert ein unvollständig geschnittenes Plasmid mit "nicked" a kürzer Abstand als lineare DNA der gleichen Größe. Folglich können Sie die Größe ungeschnittener Plasmide aus Ihrem Gel nicht abschätzen.
Ordnen Sie die Banden in jeder Spur der Identität der Probe zu, die Sie in diese Spur geladen haben, und stellen Sie fest, ob das, was Sie sehen, Ihren Erwartungen entspricht. Dies hängt von der Art Ihres Experiments ab.
Wenn Sie jedoch ein Insert-Plasmid mit zwei Restriktionsenzymen verdauen, erwarten Sie im Allgemeinen, dass das Insert vom Plasmid befreit wird.
Da es viel kleiner als das Plasmid ist, würden Sie erwarten, in dieser Spur zwei Banden zu sehen, eine in der Nähe des oberen und die andere unten in der Nähe des unteren. Ein mit nur einem Restriktionsenzym geschnittenes Plasmid sollte nur eine einzelne Bande bilden, die etwas weiter wandert als das mit zwei. geschnittene Plasmid Restriktionsenzyme, aber bei weitem nicht bis zum Einsatz.
Messen Sie den Abstand von den Wells zum geschnittenen Plasmid und fügen Sie mit Ihrem Lineal Bänder ein. Teilen Sie diese Zahlen durch die vom Tracking-Farbstoff zurückgelegte Strecke, um die relative Mobilität der Inserts und geschnittenen Plasmide zu ermitteln.