DNA-Sequenzierung: Definition, Methoden, Beispiele

Nukleotide sind die chemischen Bausteine ​​des Lebens und kommen in der DNA lebender Organismen vor. Jedes Nukleotid besteht aus ein Zucker, Phosphat und ein stickstoffhaltige Base: Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G). Die spezifische Reihenfolge dieser Nukleotidbasen bestimmt, welche Proteine, Enzyme und Moleküle von der Zelle synthetisiert werden.

Die Bestimmung der Reihenfolge oder der Sequenz von Nukleotiden ist wichtig für die Untersuchung von Mutationen, Evolution, Krankheitsverlauf, Gentests, forensische Untersuchungen und Medizin.

Genomik ist die Untersuchung von DNA, Genen, Geninteraktionen und Umwelteinflüssen auf Gene. Das Geheimnis, um das komplexe Innenleben von Genen zu enträtseln, besteht darin, ihre Struktur und Lage auf den Chromosomen zu identifizieren.

Der Bauplan lebender Organismen wird durch die Reihenfolge (oder Sequenz) der Nukleinsäure-Basenpaare in der DNA bestimmt. Bei der DNA-Replikation paart sich Adenin mit Thymin und Cytosin mit Guanin; nicht übereinstimmende Paare werden berücksichtigt Mutationen.

Da die Doppelhelix Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Molekül im Jahr 1953 konzipiert wurde, wurden dramatische Verbesserungen auf dem Gebiet der Genomik und der DNA-Sequenzierung im großen Maßstab erzielt. Wissenschaftler arbeiten intensiv daran, dieses neue Wissen auf die individualisierte Behandlung von Krankheiten anzuwenden.

Gleichzeitig ermöglichen laufende Diskussionen den Forschern, den ethischen Implikationen solcher schnell explodierenden Technologien einen Schritt voraus zu sein.

DNA-Sequenzierung ist der Prozess der Entdeckung der Sequenz verschiedener Nukleotidbasen in DNA-Schnipseln. Die Whole-Gen-Sequencing ermöglicht den Vergleich von Chromosomen und Genomen, die in der gleichen und unterschiedlichen Spezies vorhanden sind.

Die Zuordnung von Chromosomen ist für die wissenschaftliche Forschung nützlich. Analyse der Mechanismen und Struktur von Gene, Allele und chromosomale Mutationen in DNA-Molekülen legen neue Wege zur Behandlung genetischer Störungen und zum Stoppen des Wachstums von Krebstumoren.

DNA-Sequenzierungsmethoden von Frederick Sanger das Gebiet der Genomik seit den 1970er Jahren stark vorangetrieben. Sanger fühlte sich bereit, die DNA-Sequenzierung in Angriff zu nehmen, nachdem er bei der Untersuchung von Insulin erfolgreich RNA sequenziert hatte. Sanger war nicht der erste Wissenschaftler, der sich mit der DNA-Sequenzierung beschäftigte. Seine cleveren DNA-Sequenzierungsmethoden, die er gemeinsam mit den Kollegen Berg und Gilbert entwickelt hat, wurden jedoch 1980 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet.

Sanger kannte den potenziellen Wert seiner Arbeit und arbeitete oft mit anderen Wissenschaftlern zusammen, die seine Interessen an DNA teilten. Molekularbiologie und Lebenswissenschaften.

Obwohl im Vergleich zu den heutigen Sequenzierungstechnologien langsam und teuer, wurden die DNA-Sequenzierungsmethoden von Sanger damals gelobt. Nach Versuch und Irrtum fand Sanger das geheime biochemische „Rezept“, um DNA-Stränge zu trennen, mehr DNA zu erzeugen und die Reihenfolge der Nukleotide in einem Genom zu identifizieren.

Für den Einsatz in Laborstudien können problemlos hochwertige Materialien erworben werden:

• DNA-Polymerase ist das Enzym, das benötigt wird, um DNA herzustellen.
• DNA-Primer teilt dem Enzym mit, wo es mit der Arbeit am DNA-Strang beginnen soll.
• dNTPs sind organische Moleküle aus Desoxyribose-Zucker und Nukleosidtriphosphaten – dATP, dGTP, dCTP und dTTP – die Proteine ​​zusammenbauen
• Kettenabbrecher sind farbstofffarbene Nukleotide, auch Terminatornukleotide für jede Base genannt – A, T, C und G.

Sanger hat herausgefunden, wie man DNA mit dem Enzym DNA-Polymerase in kleine Segmente schneidet.

Dann stellte er mehr DNA aus einer Matrize her und fügte radioaktive Tracer in die neue DNA ein, um Abschnitte der getrennten Stränge zu markieren. Er erkannte auch, dass das Enzym einen Primer benötigt, der an eine bestimmte Stelle des Matrizenstrangs binden kann. 1981 schrieb Sanger erneut Geschichte, indem er das Genom der 16.000 Basenpaare der mitochondrialen DNA herausfand.

Die Temperatur muss während des gesamten Sequenzierungsprozesses sorgfältig eingestellt werden. Zuerst werden Chemikalien in ein Röhrchen gegeben und erhitzt, um die Doppelstränge zu entwirren (denaturieren). DNA-Molekül. Dann wird die Temperatur abgekühlt, damit die Grundierung haften kann.

Als nächstes wird die Temperatur erhöht, um eine optimale Aktivität der DNA-Polymerase (Enzym) zu fördern.

Polymerase verwendet typischerweise die normalen verfügbaren Nukleotide, die in einer höheren Konzentration hinzugefügt werden. Wenn die Polymerase ein „kettenabbrechendes“ farbstoffgebundenes Nukleotid erreicht, stoppt die Polymerase und die Kettenenden dort, was erklärt, warum die gefärbten Nukleotide „kettenabbrechend“ genannt werden oder "Terminatoren".

Der Prozess wird viele, viele Male fortgesetzt. Schließlich wurde das farbstoffgebundene Nukleotid an jeder einzelnen Position der DNA-Sequenz platziert. Gelelektrophorese und Computerprogramme können dann die Farbstofffarben auf jedem der DNA-Stränge identifizieren und Berechnen Sie die gesamte DNA-Sequenz anhand des Farbstoffs, der Position des Farbstoffs und der Länge des Stränge.

Hochdurchsatz-Sequenzierung – allgemein bezeichnet als Sequenzierung der nächsten Generation – nutzt neue Fortschritte und Technologien, um Nukleotidbasen schneller und kostengünstiger als je zuvor zu sequenzieren. Eine DNA-Sequenzierungsmaschine kann problemlos große DNA-Abschnitte verarbeiten. Tatsächlich können die gesamten Genome in wenigen Stunden erstellt werden, anstatt in Jahren mit den Sequenzierungstechniken von Sanger.

Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation können DNA-Analysen in großem Umfang ohne den zusätzlichen Schritt der Amplifikation oder Klonierung bewältigen, um genügend DNA für die Sequenzierung zu erhalten. DNA-Sequenzierungsmaschinen führen mehrere Sequenzierungsreaktionen gleichzeitig durch, was billiger und schneller ist.

Im Wesentlichen führt die neue DNA-Sequenzierungstechnologie Hunderte von Sanger-Reaktionen auf einem kleinen, leicht lesbaren Mikrochip aus, der dann durch ein Computerprogramm läuft, das die Sequenz zusammensetzt.

Die Technik liest kürzere DNA-Fragmente, ist aber dennoch schneller und effizienter als die Sequenzierungsmethoden von Sanger, sodass auch Großprojekte schnell abgeschlossen werden können.

Das Humangenomprojekt, abgeschlossen im Jahr 2003, ist eine der bekanntesten Sequenzierungsstudien, die bisher durchgeführt wurden. Laut einem Artikel aus dem Jahr 2018 in Wissenschaftsnachrichten, das menschliche Genom besteht aus ungefähr 46.831 Gene, was eine gewaltige Herausforderung für die Sequenz war. Top-Wissenschaftler aus der ganzen Welt haben fast 10 Jahre zusammengearbeitet und beraten. Geleitet von der National Human Genome Research

Institute hat das Projekt das menschliche Genom anhand einer Sammelprobe von anonymen Blutspendern erfolgreich kartiert.

Das Human Genome Project stützte sich auf bakterielle Verfahren zur künstlichen Chromosomensequenzierung (BAC-basierte), um Basenpaare zu kartieren. Bei der Technik wurden Bakterien verwendet, um DNA-Fragmente zu klonen, was zu großen DNA-Mengen für die Sequenzierung führte. Die Klone wurden dann verkleinert, in eine Sequenziermaschine gegeben und zu Abschnitten zusammengesetzt, die menschliche DNA repräsentierten.

Neue Entdeckungen in der Genomik verändern die Ansätze zur Prävention, Erkennung und Behandlung von Krankheiten grundlegend. Die Regierung hat Milliarden von Dollar für die DNA-Forschung bereitgestellt. Die Strafverfolgungsbehörden verlassen sich auf DNA-Analysen, um Fälle zu lösen. DNA-Testkits können für den Heimgebrauch erworben werden, um die Abstammung zu erforschen und Genvarianten zu identifizieren, die Gesundheitsrisiken darstellen können:

• Genomanalyse beinhaltet den Vergleich und die Gegenüberstellung der Genomsequenzen vieler verschiedener Arten in den Domänen und Reichen des Lebens. DNA-Sequenzierung kann genetische Muster aufdecken, die ein neues Licht darauf werfen, wann bestimmte Sequenzen evolutionär eingeführt wurden. Abstammung und Migration können über DNA-Analysen verfolgt und mit historischen Aufzeichnungen verglichen werden.

• Fortschritte in der Medizin passieren mit einer exponentiellen Geschwindigkeit, weil praktisch jede menschliche Krankheit eine genetische Komponente hat. Die DNA-Sequenzierung hilft Wissenschaftlern und Ärzten zu verstehen, wie mehrere Gene miteinander und mit der Umwelt interagieren. Die schnelle Sequenzierung der DNA einer neuen Mikrobe, die einen Krankheitsausbruch verursacht, kann helfen, wirksame Medikamente und Impfstoffe zu identifizieren, bevor das Problem zu einem ernsthaften Problem für die öffentliche Gesundheit wird. Genvarianten in Krebszellen und Tumoren könnten sequenziert und zur Entwicklung individualisierter Gentherapien verwendet werden.

• Kriminaltechnik Anwendungen werden seit Ende der 1980er Jahre verwendet, um den Strafverfolgungsbehörden zu helfen, Tausende von schwierigen Fällen zu lösen, so die Nationales Institut für Justiz. Tatortbeweise können DNA-Proben aus Knochen, Haaren oder Körpergewebe enthalten, die mit dem DNA-Profil eines Verdächtigen verglichen werden können, um Schuld oder Unschuld festzustellen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine häufig verwendete Methode, um vor der Sequenzierung DNA-Kopien aus Spuren zu erstellen.

• Sequenzierung neu entdeckter Arten kann helfen, herauszufinden, welche anderen Arten am engsten verwandt sind, und Informationen über die Evolution preisgeben. Taxonomen verwenden DNA-„Barcodes“, um Organismen zu klassifizieren. Laut der Universität von Georgia Im Mai 2018 gibt es schätzungsweise 303 Säugetierarten, die noch entdeckt werden müssen.

• Gentests auf Krankheiten Suchen Sie nach mutierten Genvarianten. Die meisten sind Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), was bedeutet, dass nur ein Nukleotid in der Sequenz von der „normalen“ Version geändert wird. Umweltfaktoren und Lebensstil beeinflussen, wie und ob bestimmte Gene exprimiert werden. Globale Unternehmen stellen Forschern auf der ganzen Welt, die sich für Multigen-Interaktionen und die Sequenzierung des gesamten Genoms interessieren, modernste Sequenzierungstechnologien der neuen Generation zur Verfügung.

• Genealogie-DNA-Kits verwenden DNA-Sequenzen in ihrer Datenbank, um nach Varianten in den Genen eines Individuums zu suchen. Das Kit erfordert eine Speichelprobe oder einen Wangenabstrich, der zur Analyse an ein kommerzielles Labor geschickt wird. Zusätzlich zu den Abstammungsinformationen können einige Kits Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) oder andere identifizieren bekannte genetische Varianten wie die BRCA1- und BRCA2-Gene, die mit einem erhöhten Risiko für die weibliche Brust verbunden sind und Ovarialkarzinom.

Neue Technologien bringen oft sowohl sozialen Nutzen als auch Schaden mit sich; Beispiele sind defekte Kernkraftwerke und nukleare Massenvernichtungswaffen. DNA-Technologien bergen auch Risiken.

Emotionale Bedenken bezüglich DNA-Sequenzierung und Gen-Editing-Tools wie CRISPR beinhalten die Befürchtung, dass die Technologie könnte das Klonen von Menschen erleichtern oder zu mutierten transgenen Tieren führen, die von einem Schurken geschaffen wurden Wissenschaftler.

Häufiger haben ethische Fragen im Zusammenhang mit der DNA-Sequenzierung mit der Einwilligung nach Aufklärung zu tun. Der einfache Zugang zu DNA-Tests für Verbraucher bedeutet, dass Verbraucher möglicherweise nicht vollständig verstehen, wie ihre genetischen Informationen verwendet, gespeichert und weitergegeben werden. Laien sind möglicherweise emotional nicht bereit, etwas über ihre defekten Genvarianten und Gesundheitsrisiken zu erfahren.

Dritte wie Arbeitgeber und Versicherungsunternehmen könnten potenziell Personen diskriminieren, die defekte Gene tragen, die zu ernsthaften medizinischen Problemen führen können.