Laut der BioWeb-Website der University of Wisconsin ist ein PCR-Primer ein kurzes, synthetisches Oligonukleotid (normalerweise zwischen 18 bis 25 Basen lang) zur Amplifikation bestimmter DNA-Regionen in einer molekularbiologischen Technik, die als Polymerase-Kettenreaktion bekannt ist (PCR). Es werden sowohl ein Vorwärts- als auch ein Rückwärtsprimer benötigt, die als Rückwärtskomplemente des DNA-Strangs konzipiert sind, um die gewünschte DNA-Region zu flankieren und an sie zu binden. Wenn Wissenschaftler ein bestimmtes Gen oder eine bestimmte DNA-Region erforschen möchten, müssen sie zunächst eine PCR durchführen, um genügend Zielregion zu gewinnen, mit der sie arbeiten können. Das Entwerfen von Primersequenzen für die interessierende Region kann erforderlich sein, wenn sie nicht bereits durch zuvor veröffentlichte Forschung oder durch kommerzielle Mittel erhältlich sind.
Besorgen Sie sich die Nukleotidsequenz des interessierenden Gens oder DNA-Bereichs und entscheiden Sie, wie lange ein Fragment amplifiziert werden soll. Der Vorwärts- und Rückwärtsprimer ist so konzipiert, dass er am Anfang und am Ende des gewünschten Fragments bindet. Typischerweise verwenden herkömmliche PCR-Verfahren Primer, die eine Region zwischen 100 und 1.000 Basenpaaren lang flankieren, während Echtzeit-PCR-Verfahren Fragmente mit einer Länge von etwa 50 bis 200 Basenpaaren verwenden.
Entscheiden Sie, wo in der Sequenz die Primer liegen sollen. Zum Beispiel könnten Sie die Position in der Nähe des 5'- oder 3'-Endes der Sequenz oder in der Mitte wünschen. Falls gewünscht, benennen Sie die Position der Primer, um ein Intron zu überspannen.
Entwerfen Sie Primer mit einer Länge von 18 bis 24 Basen. Vincent R. Prezioso, Ph. D., von Brinkmann Instruments Inc., schlägt vor, dass diese Länge lang genug ist, um extrem spezifisch für die gewünschte DNA-Region zu sein, aber kurz genug, um leicht zu binden (anlagern). Die Schmelztemperatur des Primers (Tm) sollte zwischen 55 und 80 Grad Celsius liegen, niedrig genug, um ein vollständiges Schmelzen bei oder über 90 Grad Celsius zu ermöglichen, aber hoch genug, um ein Glühen zu ermöglichen. Der GC-Gehalt (Prozentsatz von Gs und Cs in der Sequenz) sollte zwischen 40 und 60 Prozent liegen. Das 3'-Ende der Primersequenz sollte in einem C oder einem G (genannt GC-Klemme) enden, um die Bindung zu fördern, da G und C Nukleotide haben stärkere Bindungen, vermeiden Sie jedoch drei oder mehr Gs oder Cs in den letzten fünf Basen der Sequenz.
Vermeiden Sie Läufe von vier oder mehr einer Base (wie ACCCC...) oder vier oder mehr Dinukleotid-Wiederholungen (wie ATATATAT...), da sie Fehlpriming verursachen können. Entwerfen Sie Primer ohne Intra-Primer-Homologie (mehr als drei Basen, die sich innerhalb der einen ergänzen Primer selbst) oder Inter-Primer-Homologie (wo der Vorwärts- und Rückwärtsprimer komplementäre Sequenzen). Dies kann Selbstdimere oder Primer-Dimere verursachen, bei denen die Primer an sich selbst binden, anstatt an die gewünschte DNA-Sequenz zu binden.
Verwenden Sie Online-Ressourcen und Websites, die beim Primer-Design helfen oder Primer-Sequenzen auf Selbstkomplementarität oder das Potenzial zur Herstellung von Sekundärstrukturen wie Haarnadeln überprüfen. Einige Websites zum Thema Primer-Design umfassen Primer3 des Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast des National Center for Biotechnology Information und OligoAnalyzer von Integrated DNA Technologies.