Tris oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist ein üblicher biologischer Puffer, der während des gesamten DNA-Extraktionsprozesses verwendet wird. Während der Extraktion aus einer beliebigen Anzahl von Quellen ist DNA pH-empfindlich. Während der Zelllyse, der Entfernung unerwünschter Zellbestandteile und der Ausfällung wird Tris verwendet, um einen stabilen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus spielt es eine besonders wichtige Rolle bei der Zelllyse.
TL; DR (zu lang; nicht gelesen)
Die DNA-Extraktion ist ein pH-sensitiver Prozess, und die Verwendung eines Tris-Puffers hilft, den pH-Wert während der Zelllyse und -extraktion stabil zu halten.
Tris als Puffer
Da der pH-Wert eine Reihe von zellulären Faktoren beeinflussen und von diesen beeinflusst werden kann, ist die Aufrechterhaltung eines stabilen pH-Werts für die experimentelle Wissenschaft unerlässlich. Biologische Puffer wie Tris sind wichtig, weil sie trotz Einflüssen, die den pH-Wert sonst verschieben könnten, einen stabilen pH-Wert aufrechterhalten können. Tris(hydroxymethyl)aminomethan mit einem pKa von 8,1 ist ein wirksamer Puffer zwischen pH 7 und 9. Aufgrund seines neutralen Bereichs ist Tris ein häufig verwendeter Puffer in biologischen Labors. Tris-Puffer ist jedoch temperaturempfindlich und sollte bei der Temperatur verwendet werden, bei der er ursprünglich den pH-Wert hatte, um Ungenauigkeiten zu vermeiden.
Lyse von Zellen
Die Lyse oder das Aufbrechen der Zellen ist der erste Schritt der DNA-Extraktion. Dies wird durch einen Puffer erreicht, der Tris und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enthält. EDTA bindet zweiwertige Kationen wie Calcium und Magnesium. Da diese Ionen dazu beitragen, die Integrität der Zellmembran aufrechtzuerhalten, destabilisiert ihre Eliminierung mit EDTA die Membran. Tris ist die wichtigste Pufferkomponente; seine Hauptaufgabe besteht darin, den pH-Wert des Puffers auf einem stabilen Punkt zu halten, normalerweise 8,0. Außerdem tris interagiert wahrscheinlich mit dem LPS (Lipopolysaccharid) in der Membran und dient der Destabilisierung der Membran des Weiteren.
Tris schützt die DNA vor pH-Verschiebungen
Beim Aufbrechen der Zellen gelangen ihre DNA und ihr Inhalt in den Puffer. Außerdem sind häufig RNase A (zerstört RNA), Proteasen (zerstört Proteine) und SDS (Natriumdodecylsulfat, löst die Membranfragmente) enthalten. Zusammengenommen kann diese Suppe aus Zellinhalten und fragmentierter RNA und Proteinen einen großen Einfluss auf den pH-Wert der Lösung haben. Da DNA pH-empfindlich ist, ist es wichtig, dass Tris die Suppe puffert und den pH-Wert konstant hält.
DNA-Ausfällung
In der letzten Stufe der DNA-Extraktion wird die DNA selbst aus der Lösung extrahiert. An diesem Punkt ist die DNA im Puffer löslich. Zur Extraktion aus der Lösung wird die DNA durch Zugabe von Ethanol oder Isopropanol (Isopropylalkohol) unlöslich gemacht. Dabei wird die DNA in Lösung als weißer, fadenförmiger Stoff sichtbar. DNA kann zwar auf diese Weise aus den restlichen zellulären Bestandteilen isoliert werden, ist aber unlöslich nicht "verwendbar". Nach der Isolierung wird der Alkohol entfernt und die DNA muss zur Verwendung in einen biologischen Puffer wie Tris zurückgeführt werden.
Mach es selbst
Obwohl die DNA-Extraktion üblicherweise in Forschungslabors durchgeführt wird, verwendet man im Allgemeinen eine von mehreren im Handel erhältlichen Kits, jeder kann die DNA-Extraktion zu Hause mit üblichen Haushaltsgegenständen und Grün durchführen Erbsen oder Spinat. In diesem Fall ist weder Tris noch irgendein biologischer Puffer vorhanden, um die DNA vor pH-Verschiebungen zu schützen. Es ist jedoch eine visuelle Möglichkeit, den Schülern zu helfen, sich mit der zellulären DNA zu verbinden.