Wie eine DNA-Probe gesammelt und für das Studium vorbereitet wird

Bevor sie DNA sequenzieren oder gentechnisch verändern können, müssen Wissenschaftler sie zunächst isolieren. Dies scheint eine schwierige Aufgabe zu sein, da Zellen eine Vielzahl anderer Verbindungen wie Proteine, Fette, Zucker und kleine Moleküle enthalten. Glücklicherweise können Biologen die chemischen Eigenschaften der DNA nutzen, um die DNA von diesen Verunreinigungen zu trennen und für weitere Untersuchungen vorzubereiten. Dieser Vorgang wird als DNA-Extraktion bezeichnet.

Es gibt viele verschiedene Techniken, die für die DNA-Extraktion verwendet werden. Welches von einem einzelnen Labor verwendet wird, hängt von der Art des durchzuführenden Experiments und der Reinheit der DNA ab. Wissenschaftler beginnen im Allgemeinen mit einer zellhaltigen Probe – zum Beispiel einer Gewebe- oder Blutprobe – und brechen die Zellen auf oder lysieren sie. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Zellen zu lysieren. Das Hinzufügen eines Reinigungsmittels führt dazu, dass sie sich lösen, ebenso wie wenn sie hochfrequenten Schallwellen ausgesetzt werden. Alternativ werden die Zellen durch Mischen der Probe mit Glasperlen und schnelles Vibrieren physikalisch auseinanderbrechen und ihren Inhalt freisetzen.

Wenn keine hohe Reinheit erforderlich ist, können Wissenschaftler ein Enzym namens Proteinase K hinzufügen, um die meisten Proteine ​​​​in der Probe abzubauen, und sie dann unverändert verwenden. Diese Technik ist jedoch sehr schmutzig, da die meisten Verunreinigungen noch vorhanden sind, daher ist sie nur geeignet, wenn Geschwindigkeit Priorität hat und Reinheit kein Problem darstellt. Ein anderer schneller und schmutziger Ansatz besteht darin, Proteine ​​zu entfernen, indem die Salzkonzentration erhöht wird, indem Salze wie Ammonium- oder Kaliumacetat hinzugefügt werden, um die Proteine ​​zum Ausfällen zu zwingen. Auch diese Technik ist ziemlich schmutzig, da noch viele andere Verunreinigungen vorhanden sind.

Ein anderer Ansatz besteht darin, die Zellen mit Detergens zu lysieren und dann die Lösung mit Isoamylalkohol, Chloroform und Phenol zu mischen. Die Lösung trennt sich dann in zwei Schichten. Proteine ​​landen in der oberen organischen Schicht, während DNA in der unteren wässrigen Schicht verbleibt. Diese Technik erfordert eine sorgfältige Kontrolle der Salzkonzentration und des pH-Werts, um gute Ergebnisse zu erzielen. Es ist zeitaufwendig und sowohl Phenol als auch Chloroform sind hochgiftige Chemikalien. Während Phenol-Chloroform-Extraktionen früher Routine waren, sind in den letzten Jahren andere Techniken populärer geworden.

Die Anionenaustauschchromatographie bietet eine höhere Reinheit und konsistentere Ergebnisse als die Phenol-Chloroform-Extraktion. Ein Röhrchen oder eine Säule ist mit kleinen Partikeln gefüllt, die positiv geladene Stellen aufweisen, an denen ein negativ geladenes Molekül oder Anion binden kann. DNA bindet an diese Anionenaustauschstellen, während andere Verunreinigungen wie Proteine ​​und RNA von der Säule abgewaschen werden. Später wird mit einer salzreichen Lösung die DNA von der Säule abgezogen.

Die schnellste und vielleicht zuverlässigste Methode zur Reinigung von DNA ist die Verwendung eines speziell hergestellten Kits. Diese Kits enthalten Silicagel-Membranen in einem Röhrchen. Die DNA haftet an der Membran, während andere Verunreinigungen mit einer Reihe speziell zubereiteter Salzlösungen, die mit dem Kit geliefert werden, weggewaschen werden. Schließlich wird die DNA mit einer salzarmen Lösung von der Säule gewaschen. Diese Kits sind schnell, einfach zu verwenden und bieten reproduzierbare Ergebnisse.

Nachdem die DNA isoliert und in einer pH-kontrollierten Pufferlösung resuspendiert wurde, ist der letzte Schritt die Prüfung ihrer Reinheit. Eine einfache und bequeme Möglichkeit besteht darin, zu überprüfen, wie viel ultraviolettes Licht es bei den Wellenlängen 260 und 280 Nanometer absorbiert. Die Absorption bei 260 Nanometern geteilt durch die Absorption bei 280 Nanometern sollte 1,8 betragen, wenn die DNA rein ist. Durch die Messung der Extinktion bei 260 Nanometern können Sie auch die Konzentration der DNA bestimmen.