Der genetische Bauplan einer Zelle ist in ihrem genetischen Material oder ihrer DNA kodiert. Da die DNA niemals den Zellkern verlässt, damit diese Informationen in das Zytoplasma gelangen, wo andere Da sich Proteine und biochemische Komponenten befinden, muss die DNA zunächst in Boten-RNA (mRNA oder poly) transkribiert werden (A) RNA). Diese mRNA wird dann in Proteine übersetzt, die viele Funktionen der Zelle erfüllen. Um sehr seltene mRNAs nachzuweisen oder zu quantifizieren, Sonden für Mikroarrays herzustellen oder Bibliotheken komplementärer DNA-Moleküle zu konstruieren, muss mRNA isoliert werden. Die Extraktion der gesamten RNA (d. h. die gesamte RNA in einer Zelle) und die anschließende mRNA-Isolierung sind jedoch keine sich gegenseitig ausschließenden Prozesse; ersteres muss durchgeführt werden, damit mRNA extrahiert werden kann.
TRIzol-Homogenisierung: Gesamt-RNA umfasst alle mRNA, Transfer-RNA, ribosomale RNA und andere nicht kodierende RNAs. Um diese von anderen Zellbestandteilen zu trennen, wird die Zelle zunächst aufgerissen, um ihre Inhalt. Dies geschieht durch Resuspendieren von Zellen, die durch Zentrifugieren (Schleudern bei hohen Geschwindigkeiten) in TRIzol Reagenz (Life Technologies) pelletiert wurden. Andere Versionen von TRIzol (wie das TRI-Reagenz von Ambion) funktionieren ähnlich.
Gesamt-RNA-Isolierung: Eine Reihe von Zentrifugationen wird verwendet, um die verschiedenen Komponenten (Proteine, DNA, RNA) der Zelle in Schichten oder Phasen innerhalb der Suspension zu trennen. Die obere, gelb gefärbte Phase besteht aus Fett und kann verworfen werden. Die gewünschte Phase ist rot gefärbt, enthält die Gesamt-RNA und bleibt erhalten. Nach Durchführung einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Reihe von Alkoholwaschungen mit Isopropanol und Ethanol kann die RNA zur mRNA-Isolierung pelletiert werden. Fügen Sie RNase-Inhibitoren hinzu, um zu verhindern, dass dieses Enzym die Gesamt-RNA abbaut.
mRNA-Extraktion: Es ist üblich, ein Kit zu verwenden, um mRNAs zu isolieren, da hausgemachte Laborprotokolle keine großen Mengen erzeugen von hochgereinigten mRNAs. Kommerzielle Kits umfassen FastTrack 2.0 von Invitrogen oder die Poly (A) Pure mRNA-Isolierung von Ambion Bausatz. Diese grundlegenden Schritte sind bei solchen Kits üblich:
d) Zentrifugieren Sie diese Probe und gewinnen Sie den Überstand, der mehrmals in einer Reihe von Bindungspuffern und Puffern mit niedrigem Salzgehalt gewaschen wird, die in den Kits enthalten sind.
Verweise
- "cDNA-Bibliotheksprotokolle?"; Jan G. Cowell und Caroline A. Austin; 1997
- "In-vitro-Transkriptions- und Übersetzungsprotokolle?"; Martin J. Tymmen; 1995
Tipps
- Halten Sie alle Reagenzien, Zellen und RNA kalt, indem Sie sie in Eis tauchen. Dadurch wird verhindert, dass die RNA durch andere Enzyme abgebaut wird, die während des Homogenisierungsprozesses freigesetzt werden.
Warnungen
- Reagenzien wie TRIzol sind giftig und dürfen nicht mit Haut oder Schleimhäuten in Berührung kommen. Beachten Sie beim Umgang mit diesem Reagenz immer sichere Laborprotokolle.
Über den Autor
Palmer Owyoung hat einen Master of Arts in International Business von der University of California in San Diego und a Bachelor of Arts in Soziologie von der University of California in Santa Barbara und ausgebildeter Molekular Biologe. Seit 2006 ist er freiberuflicher Autor. Neben dem Schreiben ist er ein Vollzeit-Forex-Händler und Internet-Vermarkter.
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