Gelelektrophorese ist eine Technik, die es ermöglicht, DNA auf der Ebene ihrer konstituierenden Moleküle zu analysieren. Bei dieser DNA-Visualisierungsmethode werden Proben auf ein Agarosegelmedium gegeben und ein elektrisches Feld an das Gel angelegt. Dies bewirkt, dass DNA-Fragmente entsprechend ihren elektrochemischen Eigenschaften mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel wandern.
Ethidiumbromid
Für diese Visualisierungstechnik wird Ethidiumbromid mit Agarosepulver, EDTA-Puffer und Wasser gemischt, um die Gelmatrix vor der Elektrophorese zu bilden. Als Ergebnis werden die Ethidiumbromidmoleküle gleichmäßig in der Matrix verteilt. Sobald die Wells des Gels mit ihren jeweiligen DNA-Proben und Tracking-Farbstoffen gefüllt sind, wird Spannung angelegt, um die großen, polaren Verbindungen langsam über die Matrix zu ziehen.
Während dieser Bewegung binden die Basen der DNA-Moleküle aufgrund der Ethidiumbromid-Ladung vorübergehend an die Partikel und ziehen sie mit. Wenn die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, hat jedes DNA-Molekül eine signifikante Menge an Ethidiumbromid aufgenommen.
In Gegenwart von ultraviolettem Licht zeigt Ethidiumbromid Fluoreszenz. Techniker strahlen ein speziell kalibriertes UV-Licht über das Gel, während eine Maschine das Bild der leuchtenden Fragmente aufnimmt.
Methylenblau
Wenn kein UV-Transilluminator verfügbar oder praktisch ist, können Techniker DNA unter normalen Bedingungen sichtbar machen durch Einweichen des fertigen Agarosegels mit elektrophoretischer DNA im Inneren in einer Lösung von Methylenblau über Nacht.
Als Chloridsalz mit einem deutlich hydrophoben Anion durchdringen Methylenblau-Moleküle die gesamte Gelmatrix. Die Wasserstoffbrückenbindung in der gesamten DNA führt jedoch dazu, dass sich die Farbstoffmoleküle ansammeln. Diese erhöhte DNA-Färbungsdichte ergibt einen tieferen Blauton, der mit bloßem Auge sichtbar ist.
Tracking-Farbstoffe
Abgesehen von der relativen Größe der DNA-Banden können Techniker die absolute Größe (in Basenpaaren) jedes Fragments mit Chemikalien messen, die als Tracking-Farbstoffe bezeichnet werden. Ohne Zusatz von Methylenblau oder Ethidiumbromid sichtbar, bewegen sich Spurenfarbstoffe wie Bromphenolblau und Xylolcyanol über die Aragose-Gel-Matrizen während der Elektrophorese mit der gleichen Geschwindigkeit wie DNA-Fragmente bestehend aus 300 Nukleotiden und 4.000 Nukleotiden, beziehungsweise. Bei der Elektrophorese wandern massivere DNA-Fragmente mit geringerer Geschwindigkeit über die Gelmatrix als kleinere Fragmente. Während also Tracking-Farbstoffe die Sichtbarkeit von DNA-Fragmenten nicht direkt beeinflussen, sollte die Position eines DNA-Fragments verglichen werden im Gel an der Position dieser Farbstoffe ermöglichen es den Technikern, die ungefähre Anzahl von Nukleotiden des DNA-Fragments zu "sehen". enthält.
