Bei der Arbeit mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine gute Kalibrierung unabdingbar, um zuverlässige und qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten. Die richtige Kalibrierung eines HPLC-Geräts beginnt mit der Herstellung eines geeigneten Kalibrierstandards. Tatsächlich erfordert die Kalibrierung in den meisten Fällen eine Reihe von Standards steigender Konzentration, um eine sogenannte Kalibrierkurve zu erstellen. Dies ist eine eingezeichnete Linie und eine zugehörige Gleichung, die die Beziehung zwischen der Konzentration der zu testenden Chemikalie und der Reaktion des HPLC-Detektors beschreibt.
Bestimmen Sie die Chemikalie, auf die Sie mit der HPLC testen möchten (der "Analyt"). Sie möchten beispielsweise eine Reihe von Erfrischungsgetränken auf Fructosegehalt testen, in diesem Fall wäre Fructose der Analyt.
Besorgen Sie sich eine Menge der zu analysierenden Chemikalie geeigneter Reinheit. Normalerweise sollte die Reinheit über 99% liegen und der Analyt sollte von einem seriösen Chemikalienlieferanten bezogen werden. Im Fall von Fructose würden Sie beispielsweise reine Fructose von einem Chemikalienhändler und nicht von einem Lebensmittelgeschäft kaufen.
Bestimmen Sie die maximale und minimale erwartete Konzentration des Analyten in den Proben, die Sie auf der HPLC testen möchten. Bei Erfrischungsgetränken würden Sie die Etiketten der Getränke überprüfen und den niedrigsten und den höchsten Fruktosegehalt der getesteten Getränke ermitteln. Denken Sie daran, dass die Ausgangsprobe (das Erfrischungsgetränk) während der Vorbereitung für die Analyse verdünnt oder anderweitig manipuliert werden kann (je nach verwendeter HPLC-Methode) und so kann die Analytkonzentration in den tatsächlich auf die HPLC injizierten Proben geändert. Es ist die Analytkonzentration in den Proben, wie sie auf der HPLC durchgeführt wird, die berücksichtigt werden muss.
Bestimmen Sie das Lösungsmittel, in dem Sie Ihren Analyten auflösen, um Kalibrierstandards herzustellen. Dieses Lösungsmittel muss den Analyten über einen relativ breiten Konzentrationsbereich (mindestens so hoch wie in den zu testenden Proben) richtig lösen können. Außerdem sollte dieses Lösungsmittel idealerweise der "mobilen Phase" ziemlich ähnlich sein: dem Lösungsmittel, das verwendet wird, um Proben durch das HPLC-Gerät zu transportieren.
Berechnen Sie die Analytmenge, die erforderlich ist, um eine "Stammstandardlösung" des Analyten herzustellen. Dies wird durch Multiplizieren der erforderlichen Konzentration des Stammstandards mit dem gewünschten Volumen ermittelt. Die Konzentration des Analyten in dieser Lösung sollte mindestens 10 % höher sein als die höchste erwartete Probenkonzentration. Wenn die höchste erwartete Fructosekonzentration in einer Probe eines Erfrischungsgetränks 8 Gramm/100 Milliliter beträgt, dann könnte der Vorratsstandard auf eine Konzentration von 10 Gramm Fructose/100 Milliliter hergestellt werden. Ein sinnvolles Volumen sind 500 Milliliter, also wären 8/100 ml x 500 ml = 40 Gramm Fruktose erforderlich.
Wiegen Sie die erforderliche Analytmenge mit einer geeigneten Genauigkeit ab. Oft ist ein Gewichtswert in Gramm geeignet, der auf eine oder zwei Nachkommastellen genau ist, bei einigen Methoden kann jedoch eine höhere Genauigkeit erforderlich sein.
Überführen Sie den eingewogenen Analyten in einen Messkolben mit dem erforderlichen Volumen und geben Sie das gewünschte Lösungsmittel bis zur Füllmarkierung des Kolbens hinzu. Die Verwendung eines Messkolbens (anstelle eines Messbechers beispielsweise) erhöht die Genauigkeit des Konzentrationswertes des Stammstandards. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Analyt in den Kolben überführt wird; Verwenden Sie bei Bedarf einen Teil des Lösungsmittels zum Einwaschen.
Stellen Sie eine Reihe unterschiedlicher Verdünnungen des Stammstandards her, indem Sie bekannte Volumina des Stammstandards in Messkolben überführen, Pipetten für die genaue Übertragung verwenden und dann Lösungsmittel hinzufügen. Die niedrigste Standardkonzentration sollte unter der niedrigsten erwarteten zu analysierenden Probe liegen. Wenn im Beispiel eines Erfrischungsgetränks die niedrigste erwartete Fructosekonzentration in einer Probe 2 Gramm/100 ml beträgt, dann könnte ein 1 Gramm/100 ml-Standard hergestellt werden. Dies würde durch eine zehnfache Verdünnung des Aktienstandards erfolgen. Die Standardserie sollte insgesamt 5 oder 6 Konzentrationen umfassen, sodass zusätzliche Verdünnungen zur Herstellung von Standards von vielleicht 3, 5 und 8 Gramm Fructose/ml erforderlich wären. Sie haben nun eine Reihe von Standardlösungen, mit denen Sie die HPLC kalibrieren können.