Lyse ist ein Wort, das aus dem Griechischen stammt und lediglich „spalten“ oder „zerplatzen“ bedeutet bezieht sich darauf, was mit Zellen in einem Lysepuffer passiert, einer Lösung, die sie aufbricht, um ihre Inhalt. Wissenschaftler verwenden Lysepuffer, wenn sie DNA oder Proteine aus Zellen zur Analyse extrahieren, insbesondere bei Bakterien. Die Art des Zelllysepuffers variiert in Abhängigkeit von der Art des Experiments, obwohl die folgenden einige gängige Optionen sind.
TL; DR (zu lang; nicht gelesen)
Lysepuffer helfen dabei, Zellen aufzubrechen, sodass auf ihren Inhalt zugegriffen oder sie entfernt werden können. Einige Beispiele umfassen Salze, Detergentien, Chelatbildner und Inhibitoren und einige alkalische Chemikalien.
Puffer und Salz
Puffer stabilisieren den pH-Wert, während sich die Zellen teilen. Tris-HCL ist eine der gebräuchlichsten Chemikalien zur Pufferung bei pH 8. HEPES ist eine weitere übliche Pufferchemikalie in diesen Experimenten. Natriumchloridsalz kann auch die Ionenstärke erhöhen, die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe außerhalb der Zellen. Dieser letzte Punkt hat eine gewisse Bedeutung, da Wasser durch Zellmembranen von Regionen mit niedriger Konzentration an gelösten Stoffen zu Regionen mit hoher Konzentration an gelösten Stoffen diffundieren kann.
Auflösende Reinigungsmittel
Detergenzien lösen Zellmembranen auf, damit der Zellinhalt entweichen kann. Die haben eine amphipathische Molekülstruktur (d. h. Moleküle mit einem Ende, das leicht mit Wassermolekülen wechselwirkt, während das andere hydrophobe oder "wasserbefürchtende" Ende dies nicht tut). Sie können Fette auflösen, indem sie Micellen bilden, kleine Cluster, bei denen die hydrophoben Schwänze der Waschmittelmoleküle nach innen zu den Fettmolekülen zeigen. Zu den üblichen Reinigungsmitteln gehören Natriumdodecylsulfat oder SDS, NP-40 und TritonX.
Chelatbildner und Inhibitoren
Lysepuffer umfassen typischerweise auch Chelatbildner wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Ethylenglycoltetraessigsäure (EGTA). Diese Chemikalien binden an Metallionen mit zwei positiven Ladungen (z. B. Magnesium und Kalzium), wodurch sie für andere Reaktionen nicht verfügbar sind. Viele DNAsen (Proteine, die DNA zerkauen) und Proteasen (Proteine, die andere Proteine zerschneiden) benötigen Magnesiumionen, um EDTA und EGTA helfen, den Protease- oder DNAse-Spiegel zu reduzieren, indem sie ihnen diesen Schlüsselinhaltsstoff entziehen Aktivität. Sie schließen es jedoch nicht vollständig aus und einige Proteasen hängen nicht von Magnesium-Cofaktoren ab, also puffern Lyse enthalten manchmal auch Chemikalien, die Protease-Inhibitoren genannt werden, die an Proteasen binden und deren Funktion verhindern richtig.
Alkalische Lyse
Die alkalische Lyse, eine sehr verbreitete Technik zur Reinigung von Plasmiden aus Bakterien, umfasst drei Lösungen. Der erste enthält Glucose, Tris-HCL-Puffer, EDTA und RNAsen. Die Glukose erzeugt außerhalb der Bakterien eine hohe Konzentration an gelösten Stoffen, so dass sie ein wenig schlaff werden, was die Lyse erleichtert. EDTA und Tris-HCL funktionieren wie bereits beschrieben, während die RNAse jede RNA innerhalb der Zelle zerkaut, um sie aus dem Weg zu räumen. Die zweite Lösung lysiert die Zellen tatsächlich. Dieses enthält SDS-Detergens und NaOH, das den pH-Wert auf 12 oder höher anhebt, Proteine in der Zelle denaturiert und die DNA in Einzelstränge auftrennt. Die dritte Lösung enthält Kaliumacetat, um den pH-Wert auf ein neutraleres Niveau wiederherzustellen, damit die Plasmid-DNA-Stränge wieder zusammenkommen können. Währenddessen verklumpen die denaturierten Proteine und fallen aus, während die Dodecylsulfat-Ionen zusammen mit den Kaliumionen zu einer unlöslichen Verbindung, die ebenfalls aus der Lösung ausfällt.