Kemikere bruger højtydende væskekromatografi eller HPLC til at adskille blandinger af forbindelser. Generelt består metoden i at indsprøjte en prøve i en søjle, hvor den blandes med et eller flere opløsningsmidler. Forskellige forbindelser adsorberer eller "klæber" til kolonnen i forskellig grad; og når opløsningsmidlet skubber forbindelserne gennem søjlen, vil en af bestanddelene i blandingen først forlade søjlen. Instrumentet registrerer forbindelserne, når de forlader søjlen og producerer et kromatogram, der består af et plot med retentionstid på x-aksen og signalintensitet fra detektoren på y-aksen. Når forbindelserne forlader søjlen, frembringer de "toppe" i kromatogrammet. Generelt, jo længere fra hinanden og jo smallere toppe i kromatogrammet, jo højere er opløsningen. Forskere anser en opløsning på 1.0 eller højere for at repræsentere en passende adskillelse.
Mål bredderne på to tilstødende toppe i kromatogrammet ved at bemærke, hvor x-aksens værdier er ved bunden af hver top. X-aksen repræsenterer retentionstid, normalt målt i sekunder. Således, hvis en top begynder ved 15,1 sekunder og slutter ved 18,5 sekunder, er dens bredde (18,5 - 15,1) = 3,4 sekunder.
Bestem retentionstiderne ved at bemærke tiden, dvs. placeringen på x-aksen, der svarer til placeringen af maksimumene for toppe. Denne værdi vil normalt være ca. halvvejs mellem de to værdier, der bruges til at beregne bredden i trin 1. Eksemplet i trin 1 ville f.eks. Udvise et maksimum på ca. 16,8 sekunder.
Beregn opløsningen, R, mellem to toppe ved at:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0.5 (W_1 + W_2)}
hvor RT1 og RT2 repræsenterer retentionstiderne for toppe 1 og 2 og W1 og W2 repræsenterer bredden af toppe taget ved deres baser. Fortsat eksemplet fra trin 2 og 3 udviser en top en retentionstid på 16,8 sekunder og en bredde på 3,4 sekunder. Hvis den anden top udviste en retentionstid på 21,4 sekunder med en bredde på 3,6 sekunder, ville opløsningen være:
R = \ frac {21.4-16.8} {0.5 (3.4 + 3.6)} = 1.3
Ting, du har brug for
- HPLC-kromatogram
- Lommeregner