Hvad er frysebrydning, og hvorfor er det nyttigt i cellebiologi?

Cellemembraner består af phospholipider og vedhæftede eller indlejrede proteiner. Membranproteiner spiller vitale roller i cellens stofskifte og liv. Du kan ikke bruge almindelig mikroskopi til at visualisere eller karakterisere adhæsionsproteiner, transportere proteiner og proteinkanaler i cellemembranen. Ved hjælp af elektronmikroskopi og en teknik kaldet "frysefraktur", der opdeler frosne cellemembraner fra hinanden, muliggør visualisering af membranstrukturen og organisering af proteiner i havet af fosfolipider. Kombination af andre metoder med frysebrydning hjælper os ikke kun med at forstå strukturen af ​​forskellige cellemembraner og membranproteiner, men giver mulighed for visualisering og detaljeret analyse af funktionen af ​​specifikke proteiner, bakterier og vira.

Ved hjælp af flydende nitrogen fryses biologiske vævsprøver eller celler hurtigt for at immobilisere cellebestanddele. Cellemembraner er sammensat af to lag af phospholipider, kaldet et dobbeltlag, hvor de hydrofobe eller vandhatende lipidhaler peger på indersiden af ​​membranen og de hydrofile eller vandelskende ender af lipidmolekylet peger udad og mod indersiden af celle. Den frosne prøve er revnet eller brudt med en mikrotom, som er et knivlignende instrument til at skære tynde vævsskiver. Dette får cellemembranen til at splitte sig nøjagtigt mellem de to lag, fordi tiltrækningen mellem de hydrofobe lipidhaler repræsenterer det svageste punkt. Efter frakturering gennemgår prøven en vakuumprocedure kaldet "fryseætsning". Brudets overflade prøven skygges med kulstof og platindamp for at fremstille en stabil replika, der følger konturerne af bruddet fly. Syre bruges til at fordøje organisk materiale, der klæber til replikaen, hvilket efterlader en tynd platinskal af den brækkede membranoverflade. Denne skal analyseres derefter ved elektronmikroskopi.

Fryseætsning er vakuumtørring af en ikke-fastgjort, frossen og frysebrydet biologisk prøve. Vakuumtørringsproceduren svarer til frysetørring af frugt og grøntsager, der pakkes og sælges i købmandsforretninger. Uden fryseætsning skjules mange detaljer i cellulær struktur af iskrystaller. Dybde- eller fryseætsningstrinnet forbedrer og udvider den oprindelige frysefrakturmetode, der tillader observation af cellemembraner under forskellige aktiviteter. Det giver mulighed for analyse af ikke kun membranstrukturen, men også af intracellulære komponenter og giver detaljeret strukturel information om bakterier, vira og stort cellulært protein komplekser.

Elektronmikroskopi kan afsløre og forstørre mere end en million gange de mindste organismer eller strukturer, såsom bakterier, vira, intracellulære komponenter og endda proteiner. Visualisering skabes ved at bombardere en ultratynd prøve med en elektronstråle. De to elektronmikroskopimetoder er scanningelektronmikroskopi eller SEM og transmissionselektronmikroskopi eller TEM. Frysefrakturprøver analyseres rutinemæssigt med TEM. TEM har bedre opløsning end SEM og tilbyder strukturel information ned til 3 nanometer replikaer.

Udviklingen og anvendelsen af ​​frysefrakturelektronmikroskopi viste, at celleplasmamembraner er sammensat af lipid-dobbeltlag og tydeliggjort, hvordan proteiner er organiseret i cellemembraner. Frysefraktur giver et unikt kig på det indre af cellemembraner, fordi det opdeler og adskiller membranphospholipider i to modsatte og komplementære ark eller ansigter. I de mere end 50 år siden introduktionen af ​​den første frysefrakturmaskine er fremstilling af en platinreplika stadig den eneste måde at få strukturel information om cellemembranen på. Teknikken viser, om specifikke proteiner flyder eller er forankret i cellemembranen, og om og hvordan nogle proteiner samler sig. En nyere metode - ved hjælp af antistoffer, der er målrettet mod specifikke proteiner - kombineres med frysefraktur for at identificere proteiner og deres funktion i cellemembranen.