Gelelektroforese er en almindeligt anvendt laboratorieteknik med mange praktiske anvendelser, herunder DNA-fingeraftryk og genom-sekventering. Processen indebærer adskillelse DNA fragmenter ved hjælp af en elektrisk strøm, mens hastigheden af molekylær bevægelse spores gennem en filtreringsgel.
Tilføjelse af blå eller orange sporingsfarvestof til farveløse DNA-prøver giver dig mulighed for at se din prøve og få oplysninger om, hvordan DNA-molekyler bevæger sig under elektroforese. Identifikation er baseret på størrelsen af DNA-bånd på gelen efter migrering af molekyler.
Hvordan gelelektroforese fungerer
Gelelektroforese trækker DNA-fragmenter gennem en gel ved hjælp af en elektrisk strøm til at isolere og identificere DNA-molekyler efter størrelse og elektrisk ladning. Gelen fremstilles ofte med agarosepulver - et polysaccharid ekstraheret fra tang.
Agarose tilsættes til en bufferopløsning af vand og salt, og blandingen opvarmes og afkøles til dannelse af en porøs gel, der fungerer som en filtreringsmatrix under elektroforeseproceduren. Gelen placeres derefter i en elektroforeseenhed og dækkes med bufferopløsning, der leder
Opløsninger indeholdende DNA og ilægningsfarvestoffer pipetteres i små brønde i gelen, der skal fremstilles under gelfremstilling. Farvestofferhjælpe digse prøven tydeligt som du tilføjer til gelbrøndene i nærheden af den negative elektrode i elektroforeseenheden.
En positiv elektrode er placeret i den modsatte ende. En kendt standard af DNA-fragmenter placeres i den første brønd, der vil skabe en stige af DNA-bånd til sammenlignings- og identifikationsformål.
Fosfatrygraden i DNA-molekyler giver DNA en negativ ladning. Modsætninger tiltrækker så derfor tiltrækkes DNA-molekyler af den positive elektrode og begynder at bevæge sig eller "migrere", når en elektrisk strøm tændes.
DNA-fragmenter i mindre størrelse bevæger sig hurtigere end større fragmenter, fordi de støder på mindre modstand, når de vandrer gennem gelens porøse matrix. DNA-fragmenter med lignende størrelse danner DNA-bånd i gelen.
Indlæsning af farvestofformål og vigtighed
DNA er farveløst, så tilføjelse sporing af farvestoffer til en prøve hjælper dig bestem hastigheden for bevægelse proteinmolekyler af forskellig størrelse i gelen under elektroforese. Eksempler på ilægning af farvestoffer, der bevæger sig med DNA-prøven, inkluderer bromphenolblå og xylencyanol.
Det valgte farvestof bør ikke være reaktivt eller ændre DNA'et. Bromophenolblåt er et farvestof, der bruges til at spore mindre DNA-tråde indeholdende ca. 400 basepar, mens xylencyanol er bedre for større DNA-tråde med op til 8.000 basepar. Det valgte farvestof bør ikke være reaktivt eller ændre DNA'et.
Roll af glycerol i agarosegelelektroforese
Når du klargør din DNA-prøve til elektroforese, skal du tilføje glycerol og vand sammen med ilægningsfarvestoffer. Glycerol er et tungt, sirupagtigt stof, der giver DNA-prøven mere tæthed, før den indsættes i brøndene i den ene ende af gelarket.
Uden glycerol spredte DNA-prøven sig i stedet for at synke og danne et lag i brønden, som den skulle gøre for at danne en DNA-stige.
Tracking Dye i SDS PAGE
Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS PAGE) er en teknik, der er egnet til at adskille proteiner og aminosyrer, som er mindre og mere komplekse end lineære DNA-molekyler. Polyacrylamid (SDS PAGE gel) anvendes i stedet for agarosegel til elektroforese.
Bromophenolblåt (BPB) tilsættes til prøvebufferen som en sporingsfarvestof der bevæger sig i samme retning for adskillelse af proteiner og afgrænser deres forkant.
Rollen af DNA-bindende farvestof
DNA-bindende farvestof såsom orange farvet ethidiumbromid kan tilsættes til gel eller til elektroforesebufferen. Som navnet antyder, binder farvestoffet sig til DNA-molekylet.
Der skal udvises stor forsigtighed ved håndtering af dette mutagene farvestof, fordi det kan binde til DNA i hudceller. I modsætning til sporingsfarvestoffer, ethidiumbromid fluorescerer lyst under UV-lys, hvilket gør DNA-båndene synlige.