DNA-sekventering: definition, metoder, eksempler

Nukleotider er livets kemiske byggesten og findes i DNA fra levende organismer. Hvert nukleotid består af et sukker, fosfat og en nitrogenholdig base: adenin (A), thymin (T), cytosin (C) og guanin (G). Den specifikke rækkefølge af disse nukleotidbaser bestemmer, hvilke proteiner, enzymer og molekyler der skal syntetiseres af cellen.

Bestemmelse af rækkefølgen eller rækkefølgen af ​​nukleotider er vigtig for undersøgelsen af mutationer, evolution, sygdomsprogression, genetisk testning, retsmedicinsk undersøgelse og medicin.

Genomics er undersøgelsen af ​​DNA, gener, geninteraktioner og miljøpåvirkninger på gener. Hemmeligheden bag at afsløre genernes komplekse indre funktion er at kunne identificere deres struktur og placering på kromosomer.

Tegningen af ​​levende organismer bestemmes af rækkefølgen (eller sekvensen) af nukleinsyrebasepar i DNA. Når DNA replikerer, pares adenin med thymin og cytosin med guanin; uoverensstemmende par overvejes mutationer.

Siden den dobbelte helix

Samtidig giver igangværende diskussioner forskere mulighed for at holde sig foran de etiske implikationer af sådanne hurtigt eksploderende teknologier.

DNA-sekventering er processen med at opdage sekvensen af ​​forskellige nukleotidbaser i DNA-uddrag. Hele-gensekventering tillader sammenligninger af kromosomer og genomer til stede i den samme og forskellige art.

Kortlægning af kromosomer er nyttigt til videnskabelig forskning. Analyse af mekanismer og struktur af gener, alleler og kromosomale mutationer i DNA-molekyler antyder nye måder at behandle genetiske lidelser og stoppe for eksempel kræftvækstvækst.

Frederick Sangers DNA-sekventeringsmetoder avancerede kraftigt området med genomik fra 1970'erne. Sanger følte sig klar til at tackle DNA-sekventering efter succesfuld sekvensering af RNA, når han studerede insulin. Sanger var ikke den første videnskabsmand, der beskæftiger sig med DNA-sekventering. Hans kloge DNA-sekventeringsmetoder - udviklet sammen med kollegerne Berg og Gilbert - fik dog en Nobelpris i 1980.

Sanger kendte den potentielle værdi af sit arbejde og samarbejdede ofte med andre forskere, der delte hans interesser i DNA, molekylær Biologi og biovidenskab.

Selvom langsom og dyr i forhold til nutidens sekventeringsteknologier, blev Sangers DNA-sekventeringsmetoder hyldet på det tidspunkt. Efter forsøg og fejl fandt Sanger den hemmelige biokemiske "opskrift" til at adskille DNA-tråde, skabe mere DNA og identificere rækkefølgen af ​​nukleotider i et genom.

Højkvalitetsmaterialer kan let købes til brug i laboratorieundersøgelser:

• DNA-polymerase er det enzym, der er nødvendigt for at fremstille DNA.
• DNA-primer fortæller enzymet, hvor man skal begynde at arbejde på DNA-strengen.
• dNTP'er er organiske molekyler, der består af deoxyribosesukker og nukleosidtrifosfater - dATP, dGTP, dCTP og dTTP - der samler proteiner
• Kæde-terminatorer er farvestoffarvede nukleotider, også kaldet terminatornukleotider for hver base - A, T, C og G.

Sanger fandt ud af, hvordan man skar DNA i små segmenter ved hjælp af enzymet DNA-polymerase.

Han lavede derefter mere DNA fra en skabelon og indsatte radioaktive sporstoffer i det nye DNA for at afgrænse sektioner af de adskilte tråde. Han erkendte også, at enzymet havde brug for en primer, der kunne binde til et bestemt sted på skabelonstrengen. I 1981 skabte Sanger igen historie ved at finde ud af genomet af mitokondrie-DNA's 16.000 basepar.

Temperaturen skal justeres omhyggeligt gennem sekvenseringsprocessen. Først tilsættes kemikalier til et rør og opvarmes for at fjerne (denaturere) dobbeltstrenget DNA-molekyle. Derefter afkøles temperaturen, hvorved primeren binder.

Derefter hæves temperaturen for at tilskynde til optimal DNA-polymerase (enzym) aktivitet.

Polymerase bruger typisk de normale tilgængelige nukleotider, som tilsættes i en højere koncentration. Når polymerase kommer til et "kædeterminerende" farvestofbundet nukleotid, stopper polymerasen, og den kæde ender der, hvilket forklarer, hvorfor de farvede nukleotider kaldes "kædeafslutning" eller "Terminatorer."

Processen fortsætter mange, mange gange. Til sidst er det farvestofbundne nukleotid blevet placeret i hver enkelt position i DNA-sekvensen. Gelelektroforese og computerprogrammer kan derefter identificere farvestoffarverne på hver af DNA-strengene og finde ud af hele DNA-sekvensen baseret på farvestoffet, farvestoffets placering og længden af ​​farvestoffet tråde.

High-throughput sekventering - generelt benævnt næste generations sekventering - bruger nye fremskridt og teknologier til at sekvensere nukleotidbaser hurtigere og billigere end nogensinde før. En DNA-sekventeringsmaskine kan nemt håndtere store DNA-strækninger. Faktisk kan hele genomerne udføres i løbet af få timer i stedet for år med Sangers sekventeringsteknikker.

Næste generations sekventeringsmetoder kan håndtere DNA-analyser med stort volumen uden det ekstra trin til amplifikation eller kloning for at få nok DNA til sekventering. DNA-sekventeringsmaskiner kører flere sekventeringsreaktioner ad gangen, hvilket er billigere og hurtigere.

I det væsentlige kører den nye DNA-sekventeringsteknologi hundreder af Sanger-reaktioner på en lille letlæselig mikrochip, der derefter køres gennem et computerprogram, der samler sekvensen.

Teknikken læser kortere DNA-fragmenter, men den er stadig hurtigere og mere effektiv end Sanger's sekventeringsmetoder, så selv store projekter kan hurtigt afsluttes.

Det Human Genome Project, afsluttet i 2003, er en af ​​de mest berømte sekventeringsundersøgelser udført til dato. Ifølge en artikel i 2018 i Videnskab Nyheder, består det menneskelige genom af ca. 46.831 gener, som var en formidabel udfordring at sekvensere. Topforskere fra hele verden brugte næsten 10 år på at samarbejde og rådgive. Ledet af National Human Genome Research

Institut, projektet med succes kortlagt det menneskelige genom ved hjælp af en sammensat prøve taget fra anonyme bloddonorer.

Human Genom-projektet baserede sig på bakteriel kunstig kromosom (BAC-baseret) sekventeringsmetode for at kortlægge basepar. Teknikken brugte bakterier til at klone DNA-fragmenter, hvilket resulterede i store mængder DNA til sekventering. Klonerne blev derefter reduceret i størrelse, anbragt i en sekventeringsmaskine og samlet i strækninger, der repræsenterede humant DNA.

Nye opdagelser inden for genomik ændrer dybtgående tilgange til sygdomsforebyggelse, påvisning og behandling. Regeringen har forpligtet milliarder af dollars til DNA-forskning. Retshåndhævelse er afhængig af DNA-analyse for at løse sager. DNA-testkits kan købes til hjemmebrug for at undersøge forfædre og identificere genvarianter, der kan udgøre sundhedsrisici:

• Genomisk analyse indebærer sammenligning og kontrast af genomssekvenserne for mange forskellige arter i livets domæner og kongeriger. DNA-sekventering kan afsløre genetiske mønstre, der kaster nyt lys over, hvornår visse sekvenser blev introduceret evolutionært. Forfædre og migration kan spores via DNA-analyse og sammenlignes med historiske optegnelser.

• Fremskridt inden for medicin sker i en eksponentiel hastighed, fordi stort set enhver menneskelig sygdom har en genetisk komponent. DNA-sekventering hjælper forskere og læger med at forstå, hvordan flere gener interagerer med hinanden og miljøet. Hurtig sekventering af DNA fra en ny mikrobe, der forårsager et sygdomsudbrud, kan hjælpe med at identificere effektive lægemidler og vacciner, før problemet bliver et alvorligt folkesundhedsmæssigt problem. Genvarianter i kræftceller og tumorer kunne sekventeres og bruges til at udvikle individualiserede genterapier.

• Retsmedicinsk videnskab ansøgninger er blevet brugt til at hjælpe retshåndhævelse med at knække tusinder af vanskelige sager siden slutningen af ​​1980'erne, ifølge National Institute of Justice. Kriminalitetsbevis kan indeholde prøver af DNA fra knogle, hår eller kropsvæv, der kan sammenlignes med en mistænktes DNA-profil for at hjælpe med at bestemme skyld eller uskyld. Polymerasekædereaktionen (PCR) er en almindeligt anvendt metode til at fremstille kopier af DNA fra sporbeviser før sekventering.

• Sekventering af nyopdagede arter kan hjælpe med at identificere, hvilke andre arter der er mest beslægtede og afsløre information om evolution. Taxonomer bruger DNA “stregkoder” til at klassificere organismer. Ifølge University of Georgia i maj 2018 er der anslået 303 pattedyrarter, der endnu ikke er opdaget.

• Genetisk test for sygdomme se efter muterede genvarianter. De fleste er enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), hvilket betyder, at kun et nukleotid i sekvensen ændres fra den “normale” version. Miljøfaktorer og livsstil påvirker, hvordan og hvis bestemte gener udtrykkes. Globale virksomheder stiller banebrydende ny generation af sekventeringsteknologier til rådighed for forskere over hele verden, der er interesserede i multigen-interaktioner og helgenomsekventering.

• Slægtsforskning DNA-sæt bruge DNA-sekvenser i deres database til at kontrollere varianter i en persons gener. Sættet kræver en spytprøve eller kindpind, der sendes til et kommercielt laboratorium til analyse. Ud over information om forfædre kan nogle sæt identificere enkelt nukleotidpolymorfier (SNP'er) eller andre velkendte genetiske varianter såsom BRCA1- og BRCA2-gener associeret med forhøjet risiko for kvindeligt bryst og livmoderhalskræft.

Nye teknologier kommer ofte med muligheden for social fordel såvel som skade; eksempler inkluderer funktionsfejl i atomkraftværker og atomødestående våben. DNA-teknologier medfører også risici.

Følelsesmæssige bekymringer over DNA-sekventering og genredigeringsværktøjer som CRISPR inkluderer frygt for, at teknologi kan lette menneskelig kloning eller føre til mutante transgene dyr skabt af en slyngel videnskabsmand.

Oftere har etiske spørgsmål relateret til DNA-sekventering at gøre med informeret samtykke. Nem adgang til direkte-til-forbruger DNA-test betyder, at forbrugerne muligvis ikke fuldt ud forstår, hvordan deres genetiske information vil blive brugt, lagret og delt. Læge er måske ikke følelsesmæssigt klar til at lære om deres mangelfulde genvarianter og sundhedsrisici.

Tredjeparter som arbejdsgivere og forsikringsselskaber kan potentielt diskriminere personer, der bærer defekte gener, der kan give anledning til alvorlige medicinske problemer.