Ifølge University of Wisconsin's BioWeb-webside er en PCR-primer et kort, syntetisk oligonukleotid (normalt mellem 18 til 25 baser lange) anvendt til at amplificere specifikke DNA-regioner i en molekylærbiologisk teknik kendt som polymerasekædereaktion (PCR). Både en fremadgående og omvendt primer er nødvendig, der er designet til at være omvendte komplement af DNA-strengen, for at flankere og binde til det ønskede DNA-område. Når forskere ønsker at udføre forskning på et specifikt gen eller en region af DNA, skal de først udføre PCR for at erhverve nok af målområdet til at arbejde med. Design af primersekvenser for regionen af interesse kan være nødvendig, hvis de ikke allerede er tilgængelige gennem tidligere offentliggjort forskning eller på kommerciel måde.
Få nukleotidsekvensen for genet eller DNA-regionen af interesse, og beslut, hvor længe et fragment, du vil amplificere. Primeren til fremad og bagud er designet til at binde i begyndelsen og slutningen af det ønskede fragment. Typisk bruger konventionelle PCR-metoder primere, der flankerer et område mellem 100 og 1.000 basepar, mens realtids-PCR-metoder bruger fragmenter, der er ca. 50 til 200 basepar lange.
Beslut, hvor i rækkefølgen du vil have, at primerne skal ligge. For eksempel vil du muligvis placeringen nær 5 'eller 3' slutningen af sekvensen eller i midten. Hvis det ønskes, skal du angive placeringen af primerne for at strække sig over et intron.
Design primere til at være 18 til 24 baser i længden. Vincent R. Prezioso, Ph. D., fra Brinkmann Instruments Inc., antyder, at denne længde er lang nok til at være ekstremt specifik for den ønskede DNA-region, men kort nok til let at binde (annealere). Primersmeltetemperatur (Tm) skal være mellem 55 og 80 grader Celsius, lav nok til at muliggøre fuldstændig smeltning ved eller over 90 grader Celsius, men høj nok til at muliggøre udglødning. GC-indholdet (procentdel af G'er og C'er i sekvensen) skal være mellem 40 og 60 procent. 3'-enden af primersekvensen bør ende i en C eller en G (kaldet en GC-klemme) for at fremme binding, da G og C nukleotider har stærkere bindinger, men undgå at have tre eller flere G'er eller C'er i de sidste fem baser af sekvensen.
Undgå at have kørsler på fire eller flere af en base (som ACCCC ...) eller fire eller flere di-nukleotid-gentagelser (som ATATATAT ...), fordi de kan forårsage mispriming. Design primere uden intra-primer homologi (mere end tre baser, der supplerer inden i den ene primer i sig selv) eller inter-primer homologi (hvor den forreste og omvendte primer har komplement sekvenser). Dette kan forårsage selvdimerer eller primerdimerer, hvor primerne binder til sig selv i stedet for at binde til den ønskede DNA-sekvens.
Brug online ressourcer og websteder, der hjælper med primerdesign eller hjælper med at kontrollere primersekvenser for selvkomplementaritet eller potentialet til at lave sekundære strukturer som hårnåle. Nogle primer-designwebsteder inkluderer Massachusetts Institute of Technology's Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast og Integrated DNA Technologies 'OligoAnalyzer.