Tris eller tris (hydroxymethyl) aminomethan er en almindelig biologisk buffer, der anvendes gennem DNA-ekstraktionsprocessen. Under ekstraktion fra et hvilket som helst antal kilder er DNA pH-følsomt. Under cellelyse, fjernelse af uønskede cellulære komponenter og udfældning anvendes tris til at opretholde en stabil pH. Derudover spiller det en særlig vigtig rolle i cellelyse.
TL; DR (for lang; Har ikke læst)
DNA-ekstraktion er en pH-følsom proces, og brug af en tris-buffer hjælper med at holde pH stabil over cellelyse og ekstraktion.
Tris som en buffer
Da pH kan påvirke og blive påvirket af en række cellulære faktorer, er det vigtigt for eksperimentel videnskab at opretholde en stabil pH. Biologiske buffere, ligesom tris, er vigtige, fordi de kan opretholde en stabil pH på trods af påvirkninger, der ellers kan skifte pH. Tris (hydroxymethyl) aminomethan med en pKa på 8,1 er en effektiv buffer mellem pH 7 og 9. På grund af dets neutrale rækkevidde er tris en almindeligt anvendt buffer i biologiske laboratorier. Tris-puffer er imidlertid temperaturfølsom og bør bruges ved den temperatur, ved hvilken den oprindeligt blev pH-værdi, for at undgå unøjagtighed.
Lyse af celler
Lyse eller at åbne cellerne er det første trin i DNA-ekstraktion. Dette opnås ved hjælp af en puffer indeholdende tris og EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre). EDTA binder divalente kationer som calcium og magnesium. Da disse ioner hjælper med at bevare integriteten af cellemembranen, destabiliserer membranen ved at fjerne dem med EDTA. Tris er den vigtigste bufferkomponent; dets hovedrolle er at opretholde bufferens pH på et stabilt punkt, normalt 8,0. Derudover tris interagerer sandsynligvis med LPS (lipopolysaccharid) i membranen og tjener til at destabilisere membranen yderligere.
Tris beskytter DNA mod pH-skift
Når cellerne brydes fra hinanden, spildes deres DNA og indhold i bufferen. Derudover er RNase A (ødelægger RNA), proteaser (ødelægger proteiner) og SDS (natriumdodecylsulfat, opløser membranfragmenterne) ofte inkluderet. Samlet set kan denne suppe med celleindhold og fragmenteret RNA og proteiner have stor indflydelse på opløsningens pH. Fordi DNA er pH-følsomt, er det vigtigt for tris at buffere suppen og opretholde pH på et stabilt punkt.
DNA-nedbør
I den sidste fase af DNA-ekstraktion ekstraheres DNA'et fra opløsningen. På dette tidspunkt er DNA'et opløseligt i bufferen. For at ekstrahere fra opløsningen gøres DNA uopløseligt ved tilsætning af ethanol eller isopropanol (isopropylalkohol). Når dette er gjort, bliver DNA'et indlysende i opløsning som et hvidt, allerede stof. Selvom DNA kan isoleres fra de resterende cellulære komponenter på denne måde, er det ikke "anvendeligt", når det er uopløseligt. Efter isolering fjernes alkoholen, og DNA skal returneres til en biologisk buffer, som tris, for at blive brugt.
Gør det selv
Selvom ekstraktion af DNA almindeligvis udføres i forskningslaboratorier generelt ved hjælp af en af et antal kommercielt tilgængelige sæt, kan enhver udføre DNA-ekstraktion derhjemme ved hjælp af almindelige husholdningsartikler og grøn ærter eller spinat. I dette tilfælde er tris eller nogen biologisk buffer ikke til stede for at beskytte DNA'et mod pH-forskydninger. Det er dog en visuel måde at hjælpe eleverne med at oprette forbindelse til cellulært DNA.