En celles genetiske tegning er kodet i dens genetiske materiale eller DNA. Da DNA aldrig forlader cellekernen, for at denne information skal komme ind i cytoplasmaet, hvor andre proteiner og biokemiske komponenter ligger, er det nødvendigt først at transkribe DNA'et i messenger-RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Dette mRNA bliver derefter oversat til proteiner, der udfører mange funktioner i cellen. For at detektere eller kvantificere meget sjældne mRNA'er, lave prober til mikroarrays eller konstruere biblioteker med komplementære DNA-molekyler skal mRNA isoleres. Ekstraktion af total RNA (dvs. al RNA i en celle) og efterfølgende mRNA-isolering er imidlertid ikke gensidigt eksklusive processer; førstnævnte skal udføres for at mRNA skal ekstraheres.
TRIzol-homogenisering: Total RNA inkluderer alt mRNA, transfer-RNA, ribosomalt RNA og andet ikke-kodende RNA'er. For at adskille disse fra andre cellulære komponenter sprænges cellen først for at frigive dens indhold. Dette gøres ved at resuspendere celler pelleteret ved centrifugering (centrifugering ved høje hastigheder) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versioner af TRIzol (såsom Ambions TRI-reagens) fungerer på samme måde.
Total RNA-isolering: En række centrifugeringer bruges til at adskille de forskellige komponenter (proteiner, DNA, RNA) i cellen i lag eller faser inden i suspensionen. Den øverste gulfarvede fase består af fedt og kan kasseres. Den ønskede fase er tonet rød, indeholder det totale RNA og bevares. Efter at have udført en phenol-chloroform-ekstraktion og en række alkoholvask ved hjælp af isopropanol og ethanol, kan RNA pelleteres til mRNA-isolering. Tilføj RNase-hæmmere for at forhindre dette enzym i at nedbryde den samlede RNA.
mRNA-ekstraktion: Det er almindeligt at bruge et kit til at isolere mRNA'er, da hjemmelavede laboratorieprotokoller ikke genererer store mængder af stærkt oprensede mRNA'er. Kommercielle sæt inkluderer Invitrogens FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Disse grundlæggende trin er fælles for sådanne sæt:
d) Centrifuger denne prøve og genvind supernatanten, som vaskes flere gange i en række bindingsbuffere og lave saltbuffere tilvejebragt i kittene.
Referencer
- "cDNA-biblioteksprotokoller?"; Ian G. Cowell og Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro-transskriptions- og oversættelsesprotokoller?"; Martin J. Tymmer; 1995
Tips
- Hold alle reagenser, celler og RNA koldt ved nedsænkning i is. Dette forhindrer, at RNA nedbrydes af andre enzymer, der frigøres under homogeniseringsprocessen.
Advarsler
- Reagenser som TRIzol er giftige og må ikke være i kontakt med hud eller slimhinder. Overhold altid sikre laboratorieprotokoller, når du håndterer dette reagens.
Om forfatteren
Palmer Owyoung har en Master of Arts i international forretning fra University of California i San Diego og en Bachelor of Arts i sociologi fra University of California i Santa Barbara og er uddannet molekylær biolog. Han har været freelance skribent siden 2006. Ud over at skrive er han en fuldtids forexhandler og internetmarkedsfører.
Fotokreditter
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images