Når du arbejder med højtydende væskechromatografi (HPLC), er god kalibrering absolut nødvendig for at sikre pålidelige kvalitetsresultater. Korrekt kalibrering af et HPLC-instrument begynder med at udarbejde en passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfælde kræver kalibrering faktisk en række standarder for stigende koncentration for at producere det, der kaldes en kalibreringskurve. Dette er en afbildet linje og tilhørende ligning, der beskriver forholdet mellem koncentrationen af det kemikalie, der testes for, og HPLC-detektorens respons.
Bestem det kemikalie, som du ønsker at teste for ved hjælp af HPLC ("analytten"). For eksempel vil du måske teste en række læskedrikke for fruktoseindhold, i hvilket tilfælde fruktose ville være analytten.
Få en mængde af analytkemikaliet med passende renhed. Normalt bør renheden være over 99%, og analytten skal købes fra et velrenommeret kemikalieforsyningsselskab. I tilfælde af fruktose vil du f.eks. Købe ren fruktose fra en kemisk leverandør og ikke fra en købmand.
Bestem analytens maksimale og mindste forventede koncentrationer i de prøver, du har til hensigt at teste på HPLC. I tilfælde af læskedrikke ville du undersøge etiketterne på drikkevarerne og bestemme det laveste og højeste fruktoseindhold blandt de drikkevarer, du vil teste. Husk, at den indledende prøve (læskedrikken) kan fortyndes eller på anden måde manipuleres under forberedelse til analyse (afhængigt af den anvendte HPLC-metode) og således kan analytkoncentrationen i de prøver, der faktisk injiceres på HPLC være ændret. Det er analytkoncentrationen i prøverne, der køres på HPLC, der skal overvejes.
Bestem opløsningsmidlet, hvori du vil opløse din analyt til at udgøre kalibreringsstandarder. Dette opløsningsmiddel skal være i stand til at opløse analytten korrekt over et relativt bredt koncentrationsområde (mindst lige så højt som i de prøver, du har til hensigt at teste). Ligeledes bør dette opløsningsmiddel ideelt være meget lig den "mobile fase:" opløsningsmidlet, der anvendes til at føre prøver gennem HPLC-instrumentet.
Beregn mængden af analyt, der kræves for at fremstille en "stamstandard" -opløsning af analyten. Dette findes ved at multiplicere den krævede koncentration af lagerstandarden med det ønskede volumen. Koncentrationen af analytten i denne opløsning skal være mindst 10% højere end den højeste forventede prøvekoncentration. Hvis den højest forventede fructosekoncentration i en læskedriksprøve er 8 gram / 100 ml, kan stamstandarden bringes til en koncentration på 10 gram fruktose / 100 ml. Et rimeligt volumen er 500 milliliter, så der kræves 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktose.
Afvej den krævede mængde analyt til et passende niveau af præcision. Ofte er en vægtværdi i gram nøjagtig til en eller to decimaler egnet, men mere præcision kan være nødvendig for nogle metoder.
Overfør den afvejede analyt til en målekolbe med det nødvendige volumen og tilsæt det ønskede opløsningsmiddel til fyldmærket på kolben. Brug af en målekolbe (for eksempel i stedet for et gradueret bægerglas) øger præcisionen af lagerstandardkoncentrationsværdien. Sørg for, at al analyt er overført til kolben; Brug noget af opløsningsmidlet til at vaske det ind, hvis det er nødvendigt.
Lav en række forskellige fortyndinger af stamstandarden ved at overføre kendte volumener af stamstandarden til målekolber ved hjælp af pipetter til nøjagtig overførsel og derefter tilsætte opløsningsmiddel. Den laveste standardkoncentration skal være under den laveste forventede prøve, der skal analyseres. I sodavandeksemplet, hvis den laveste forventede fruktosekoncentration i en prøve er 2 gram / 100 ml, kunne der oprettes en 1 gram / 100 ml standard. Dette ville ske ved en tidobbelt fortynding af lagerstandarden. Standardserien skal indeholde i alt 5 eller 6 koncentrationer, så der kræves yderligere fortyndinger for at producere standarder på måske 3, 5 og 8 gram fruktose / ml. Du har nu en række standardløsninger, som du kan kalibrere HPLC med.