Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) er en biokemisk metode til identifikation af proteiner i opløsning. Som illustreret af Mathews et al. I "Biokemi" anbringes proteinprøver først i "brønde" eller huller i den ene ende af polyacrylamidgelblokken. Et elektrisk felt påføres derefter på gelen. SDS, tilsat til de ilagte prøver, negerer den naturlige ladning af proteiner. Af denne grund bestemmer proteinmolekylvægt alene migrationshastigheden af proteiner, når de bevæger sig gennem gelen mod den positivt ladede pol, bemærker Bitesize Bio. Flere proteiner i den samme prøve adskiller sig derfor fra hinanden og migrerer til forskellige positioner.
Orienter gelfotografiet. "Top" er placeringen af de brønde, hvor prøverne oprindeligt blev tilføjet. "Nederst" er hvor prøverne vandrede mod og ofte indeholder farvestoffronten, der angiver den vandrende front af prøverne. Enten venstre eller højre skal indeholde en "markør", der bruges som en forudsigelig molekylvægt.
Mærk prøverne for hver bane. Over toppen vil de prøver, der er føjet til brøndene, have migreret lodret i "baner". Derfor kom alle bjælker, der var synlige i en lodret søjle, fra den ene prøve, der var lagt direkte over den. Brug linealen og pennen til at sætte grænser på banerne, hvis det er vanskeligt at visualisere kolonner.
Mærk de molekylære størrelser af båndene i markørbanen. Kommercielt tilgængelige markører leveres med et billede af båndmønsteret, som man kan forvente sammen med molekylvægten for hvert bånd. Bånd er de mørke horisontale "barer", som faktisk er farvet protein indlejret i gelen.
Tegn lette vandrette linjer, der strækker sig ud fra hvert markørbånd til den modsatte kant af gelen. Pas på at gøre disse linjer parallelle med brøndene og farvestoffronten. Disse linjer angiver, hvor proteiner med molekylvægten angivet af hvert af markørbåndene vil være placeret i hver bane. For eksempel et bånd i bane 4, der ligger lige under linjen, der strækker sig fra 25-kilodalton markørbånd antyder, at bane 4-båndet er næsten, men ikke helt, 25 kilodalton i molekylær vægt.
Mærk hvert bånd i hver bane med dets estimerede molekylvægt. Brug markørerne som en vejledning, og estimer værdier mellem markørstørrelser.
Lav en liste over "proteiner" for hver bane under gelfotografiet. Begynd med at angive, hvad der er kendt om hver prøve, såsom dens oprindelse eller betingelser. Angiv derefter den estimerede molekylvægt for hvert bånd i banen. Baner med et bånd indikerer, at prøven kun indeholder et protein. Baner med flere bånd indikerer tilstedeværelsen af flere proteiner. Bånd, der kører med migreringsfronten, er mindre end foreslået af den nærmeste markør og kan sandsynligvis ikke forudsiges undtagen som "mindre end" markøren indikerer.
Bemærk proteinerne på listen over proteiner. Et "udtværet" udseende kan indikere, at for mange proteiner er til stede, eller at viskositeten af prøven påvirkede dens migration Hvis bånd ser ud til at gå ud over banens kant eller er ret store sammenlignet med andre bånd, så er koncentrationen af dette protein sandsynligvis for høj og bør fortyndes i fremtiden elektroforese. En grålig farvetone i hele banen, mørkere end baggrundsgelfarven, indikerer ikke skelne proteinfragmenter.
Bestem identiteten af proteinerne i hver bane. Selvom dette kun udføres ved hjælp af molekylvægt, vil kilden til hver bane sandsynligvis også indikere spor. Overvej, at proteiner under nogle betingelser kan opretholde en dimer- eller trimerforbindelse på en gel. Derfor kan et protein vises på en gel som tre forskellige bånd. Selvom proteiner ikke kan identificeres, kan båndens relative mørke antyde koncentrationerne af proteinerne i opløsning. Alle nysgerrige og ukendte proteiner kan isoleres direkte fra den originale gel og sendes til identifikation.
Ting, du har brug for
- Foto af SDS-PAGE gel, farvet
- Nøgle til den anvendte molekylvægtmarkør
- Lineal
- Pen