Jaký je první krok v polymerázové řetězové reakci?

Polymerázová řetězová reakce neboli PCR je technika, která fotokopíruje jeden fragment DNA na mnoho fragmentů - exponenciálně mnoho. Prvním krokem v PCR je zahřátí DNA tak, aby denaturovala nebo se roztavila na jednotlivé řetězce. Struktura DNA je jako provazový žebřík, ve kterém jsou příčky provazy s magnetickými konci. Magnety se spojují a tvoří příčky, které se nazývají páry bází, a tak odolávají roztažení. Každý fragment DNA se při různých teplotách roztaví na jednotlivé řetězce. Pochopení toho, jak je struktura DNA držena pohromadě jednotlivými částmi DNA, poskytne vhled do proč různé fragmenty DNA se taví při různých teplotách a proč jsou takové vysoké teploty potřebné v první místo.

Prvním krokem PCR je roztavení DNA tak, aby se dvouvláknová DNA rozdělila na jednořetězcovou DNA. U savčí DNA tento první krok obvykle zahrnuje teplo přibližně 95 stupňů Celsia (asi 200 stupňů Fahrenheita). Při této teplotě se vodíkové vazby mezi páry bází A-T a G-C nebo příčky v žebříčku DNA rozpadnou a rozepnou dvouvláknovou DNA. Teplota však není dostatečně vysoká, aby rozbila páteř fosfátového cukru, která tvoří jednotlivé prameny, nebo póly žebříku. Úplná separace jednotlivých řetězců je připravuje na druhý krok PCR, který je ochlazen, aby se krátké fragmenty DNA, nazývané primery, mohly vázat na jednotlivé řetězce.

Jedním z důvodů, proč se DNA zahřívá na vysokou teplotu 95 stupňů Celcius, je to, že čím delší je dvouvlákna DNA, tím více chce zůstat pohromadě. Délka DNA je jedním z faktorů, který ovlivňuje teplotu tání zvolenou pro PCR na tomto kousku DNA. Páry bází A-T a G-C ve dvojvláknové DNA se navzájem váží, aby držely dvouvláknovou strukturu pohromadě. Čím více po sobě jdoucích párů bází mezi dvěma jednovláknovými vlákny se spojilo, tím více se jejich sousedé také chtějí spojit a tím silnější je přitažlivost mezi těmito dvěma vlákny. Je to jako zip vyrobený z malých magnetů. Když zapnete zip, magnety se přirozeně budou chtít zapnout na zip a zůstat na zip.

Dalším faktorem, který ovlivňuje, jakou teplotu tání zvolit pro váš fragment DNA, který vás zajímá, je množství párů bází G-C přítomných v tomto fragmentu. Každý základní pár je jako dva mini magnety, které přitahují. Dvojice vyrobená z G a C je přitahována mnohem silněji než dvojice A a T. Kus DNA, který má více párů G-C než jiný fragment, tedy bude vyžadovat vyšší teplotu, než se roztaví na jednotlivé řetězce. DNA přirozeně absorbuje ultrafialové světlo - přesněji na vlnové délce 260 nanometrů - a jednovláknová DNA absorbuje více světla než dvouvláknová DNA. Měření množství absorbovaného světla je tedy způsob, jak měřit, kolik se vaše dvouvláknová DNA roztavila na jednotlivé řetězce. Účinek „magnetického zipu“ párů bází G-C a A-T způsobuje graf absorbance světla dvouvláknová DNA vynesená proti zvýšení teploty tak, aby byla sigmoidní, ve tvaru S, a ne a přímka. Křivka S představuje odpor týmové práce, který páry bází působí proti horku, protože se nechtějí oddělit.

Teplota, při které se délka DNA roztaví na jednotlivé řetězce, se nazývá teplota tání, která se označuje zkratkou „Tm“. To naznačuje teplotu, při které se polovina DNA v roztoku roztavila na jednořetězce a druhá polovina je stále ve dvouřetězci formulář. Teplota tání je pro každý fragment DNA odlišná. Savčí DNA má obsah G-C 40%, což znamená, že zbývajících 60% párů bází jsou As a Ts. Jeho 40% obsah G-C způsobuje, že se savčí DNA roztaví při 87 stupních Celsia (asi 189 Fahrenheita). Proto je prvním krokem PCR na savčí DNA zahřátí na 94 stupňů Celsia (201 Fahrenheita). Jen o sedm stupňů teplejší než teplota tání a všechny dvojité prameny se úplně roztaví na jednotlivé prameny.