Gelová elektroforéza je technika, při které jsou biologické molekuly od sebe odděleny a identifikovány v biologickém výzkumu nebo lékařské diagnostice. Od svého vývoje v 70. letech byly tyto techniky neocenitelné při identifikaci genů (DNA) a genových produktů (RNA a proteinů), které jsou předmětem výzkumu. V posledních letech se objevily novější techniky, které poskytují větší přesnost a podrobnosti o tom, co se děje v živých systémech. I když tyto metody nenahradily elektroforetické techniky a pokročilé manipulace mohou rozšířit životaschopnost této techniky, je důležité si uvědomit, co může a nemůže gelová elektroforéza.
Elektroforéza má omezenou analýzu vzorků
Elektroforéza je specifická pro jakoukoli tkáň, ze které jste odebrali vzorky. Například pokud provedete Southern blot (typ elektroforézy) na lícním tampónu, díváte se na geny z epiteliálních buněk vaší tváře a nikde jinde ve vašem těle. Někdy to může být prospěšné, ale vědci se často zajímají o rozšířenější účinky.
Techniky, jako je hybridizace in situ (ISH), mohou odebrat část tkáně a analyzovat genovou expresi v každé malé oblasti daného vzorku. Vědci se tak mohou podívat na každou oblast mozku ve vzorku pomocí ISH, zatímco techniky elektroforézy se mohou dívat pouze na několik oblastí najednou.
Měření elektroforézou nejsou přesná
Gelová elektroforéza může účinně oddělit podobné proteiny s různou hmotností (jedná se o techniku zvanou Western blot). Může je přesněji oddělit pomocí techniky známé jako 2D elektroforéza; to je v proteomice běžné.
Bohužel všechna měření provedená touto technikou jsou přinejlepším semikvantitativní. Aby bylo možné získat přesnou hmotnost (hmotnost) proteinů, musí být po vyčištění proteinu elektroforézou použita hmotnostní spektroskopie. Porovnání relativního množství různých molekul navíc závisí na hustotě pásu (temnotě) různých skvrn na gelu. Tato metoda má určitý stupeň chyby a vzorky se obvykle spouští vícekrát, aby se získaly čisté výsledky.
Je vyžadován podstatný počáteční vzorek
Elektroforéza je technika izolace a vizuální identifikace různých biomolekul. To se provádí průchodem elektrického proudu gelem k oddělení nabitých molekul různých hmotností. Pokud molekula, o kterou se zajímáte, není dostatečně běžná, její pás bude prakticky neviditelný a obtížně měřitelný.
DNA a RNA mohou být před provedením elektroforézy poněkud amplifikovány, ale není praktické to dělat pomocí proteinů. K provedení těchto testů je proto zapotřebí velký vzorek tkáně. To může omezit užitečnost techniky, zejména v lékařské analýze. Je prakticky nemožné provést elektroforézu na vzorky z jedné buňky; průtoková cytometrie a imunohistochemie se běžněji používají k hodnocení buněčné exprese proteinů. Technika zvaná PCR je vynikající při přesném měření malého množství RNA.
Lze vizualizovat pouze určité molekuly
Elektroforéza je vynikající při oddělování a identifikaci středních až velkých biomolekul. Mnoho molekul, na které se vědci chtějí podívat, je však menších; malé hormony, neurotransmitery a ionty nelze měřit elektroforézou. Je to ze dvou důvodů: nereagují správně s přípravou pro elektroforézu (obvykle technika SDS PAGE), ai kdyby ano, jsou příliš malé na to, aby se správně oddělily, a vyběhly by na dno gel. Tyto molekuly se místo toho měří technikami, jako jsou RIAA (radioimunoanalýzy) a ELISA (enzymová imunoanalýza).
Elektroforéza má nízkou propustnost
Gelová elektroforéza má obecně nízkou propustnost, což znamená, že neprodukuje data zvlášť rychle. Kontrastní elektroforéza, kde se můžete podívat na malou hrstku molekul RNA najednou, pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce), která dokáže současně vyhodnotit tisíce vzorků. Podobně může průtoková cytometrie provádět měření z tisíců jednotlivých buněk a zkomplikovat je korelace, zatímco elektroforéza se dívá na buňky hromadně a nemůže být tak jemná diskriminace. PCR a průtoková cytometrie představují masivně paralelní a sériové procesy a oba daleko předčí schopnosti elektroforézy generovat výzkumná data.