DNA
Kyselina deoxyribonukleová a proteiny. DNA je organizována do jednotek zvaných geny, z nichž každý kóduje konkrétní RNA nebo proteinovou sekvenci. Geny jsou studovány, aby se dozvěděly o biologické struktuře a funkci, evoluci, nemoci a mnoha dalších aspektech živých systémů. Abychom mohli podrobně studovat geny, musí být DNA izolována a purifikována ze sledovaných buněk.
Extrakce DNA
Ačkoli DNA z jedné buňky lze extrahovat a studovat, nestačí to vidět pouhým okem. Abyste získali dostatečné množství pro zařazování, tím více buněk musíte pracovat, tím lépe (mnoho milionů).
Přesné protokoly se značně liší, aby zohlednily jedinečné vlastnosti konkrétních vzorků, ale obecnými kroky jsou homogenizace, lýza, digesce, separace a sběr. Postup se nejlépe provádí v malé (v závislosti na velikosti vzorku) skleněné nebo plastové zkumavce.
Vzorek se obecně smísí nebo rozemele, aby se buňky od sebe důkladně oddělily. Díky tomu jsou buněčné přísady přístupnější pro následující činidla. K homogenátu se poté přidá detergent nebo enzymy, aby se lyžovaly buněčné membrány (a jaderné membrány, pokud jsou buňky eukaryotické), aby se uvolnila DNA. V tomto okamžiku je DNA obklopena bílkovinami, lipidy, uhlohydráty, vše, co bylo v buňkách obsaženo.
Může být nutné další enzymatické štěpení, aby se rozložily proteiny, aby se nevažely na DNA a nezasahovaly do jejího shromažďování. DNA se oddělí od zbytku buněčného obsahu přidáním studeného, čistého, ethylového nebo isopropylalkoholu. DNA není v těchto alkoholech rozpustná, takže se kondenzuje a snaží se minimalizovat její kontakt s alkoholem. Kondenzované DNA se poté shromáždily, obvykle centrifugací nebo zařazením.
Zařazování DNA
Sběr DNA zařazením je účinný, pokud se z extrakčního postupu získá velké množství DNA. Je to také vynikající demonstrační metoda, protože je jasně viditelná působivá spleť čisté DNA.
K navinutí DNA musí být separační krok proveden opatrně. Pokud nebyla součástí dříve přidané směsi lyzačního činidla, musí se k roztoku před krokem přidání alkoholu přidat koncentrovaný solný roztok (chlorid sodný). Studený alkohol se pomalu nalije po straně zkumavky, aby se vytvořila vrstva na horní straně vodného roztoku, přičemž se zabrání míchání. Pokud je to provedeno správně, alkohol vytvoří na slané vrstvě vlastní vrstvu. Pak přichází zařazování.
Chcete-li sbírat DNA ze slané vrstvy, opatrně položte skleněnou míchací tyč přes vrstvu alkoholu, dokud se nedotkne dna zkumavky. Pomalu otáčejte prutem mezi prsty a sledujte rozhraní mezi dvěma vrstvami. Pokud je přítomno dostatek DNA, shlukuje se na rozhraní mezi vrstvami a vytvoří mléčně průsvitnou hmotu. Otočte tyč, aby se kolem ní ovinula DNA (tj. Navíjecí část), a vytáhněte ji ze zkumavky. DNA může být přenesena do jiné zkumavky s čistým alkoholem pro skladování nebo další analýzu.