Klonování DNA: definice, postup, příklady

Je možné klonovat celé organismy, jako je ovce Dolly, ale klonování DNA je jiné. Vyrábí techniky molekulární biologie identické kopie sekvencí DNA nebo jednotlivé geny.

Pomocí metod genetického inženýrství jsou identifikovány a izolovány segmenty genetického kódu DNA. Klonování DNA pak kopíruje nukleová kyselina sekvence v segmentech.

Výsledné identické kopie lze použít pro další výzkum nebo pro biotechnologické aplikace. Kopírovaný gen často kóduje protein, který může být součástí lékařské léčby. Technologie DNA včetně Klonování DNA podporuje pochopení toho, jak fungují geny a jak genetický kód člověka ovlivňuje fungování těla.

Klonování DNA je proces molekulární biologie vytváření identických kopií segmentů DNA umístěných v chromozomech, které obsahují genetický kód pokročilých organismů.

Tento proces generuje velké množství cílové sekvence DNA. Cílem klonování DNA je produkce samotných cílových sekvencí DNA nebo produkce proteinů kódovaných v cílových sekvencích.

Jsou nazývány dvě metody používané při klonování DNA plazmidový vektor a polymerázová řetězová reakce (PCR). V plazmidový vektor metoda, DNA řetězce jsou řezány pomocí restrikční enzymy k produkci fragmentů DNA a výsledné segmenty jsou vloženy do klonovacích vektorů nazývaných plazmidy pro další duplikaci. Plazmidy jsou umístěny v bakteriálních buňkách, které pak produkují kopie DNA nebo kódované proteiny.

V Metoda PCR, segment řetězců DNA, který má být duplikován, je označen enzymy zvanými primery. Enzym polymerázy vytváří kopie označené části řetězce DNA. Tato metoda nepoužívá restrikční enzymy a může produkovat klonovanou DNA z malých vzorků. Někdy se tyto dvě technologie DNA používají společně k začlenění těch nejlepších vlastností do celkové reakce.

Vektor způsobu označuje plazmid použitý k držení cílového segmentu DNA, který má být klonován. Plazmidy jsou malé kruhové prameny nechromozomální DNA nachází se v mnoha organismech včetně bakterií a virů.

Bakteriální plazmidy jsou vektor používaný pro vložení cílového segmentu DNA do bakteriálních buněk pro další duplikaci.

Výběr a izolace cílové DNA: Před zahájením procesu klonování DNA je třeba identifikovat sekvence DNA, zejména počátky a konce segmentů DNA.

Takové sekvence DNA lze nalézt pomocí existující klonované DNA se známými sekvencemi nebo studiem proteinu produkovaného cílovou sekvencí DNA. Jakmile je sekvence známá, lze použít odpovídající restrikční enzymy.

Řezání cílové DNA restrikčními enzymy: Restrikční enzymy jsou vybrány tak, aby hledaly kód DNA na začátku a na konci cílových sekvencí.

Když restrikční enzymy naleznou speciální kódovanou sekvenci párů bází nazývaných restrikční místa, jsou připojí se k DNA na tomto místě a přetočí se kolem molekuly DNA, čímž se rozdělí pramen. Nařezané segmenty DNA obsahující cílovou sekvenci jsou nyní k dispozici pro duplikaci.

Výběr plazmidového vektoru a vložení cílové DNA: Vhodný plazmid ideálně obsahuje stejné sekvence kódující DNA jako řetězec DNA, ze kterého byla cílová DNA vyříznuta. Kruhové vlákno DNA plazmidu je štěpeno stejnými restrikčními enzymy, jaké byly použity pro štěpení cílové DNA.

A Enzym DNA ligázy se používá k podpoře spojování segmentů DNA a konce cílového segmentu DNA se spojují s odříznutými konci plazmidové DNA. Cílová DNA nyní tvoří část řetězce kruhového plazmidu DNA.

Vložení plazmidu do bakteriální buňky: Jakmile plazmid obsahuje sekvenci DNA, která má být klonována, skutečné klonování může probíhat pomocí procesu zvaného bakteriální transformace. Plazmidy jsou vloženy do bakteriální buňky, jako je E. coli a buňky s novými segmenty DNA začnou produkovat kopie a odpovídající proteiny.

Při bakteriální transformaci jsou hostitelské buňky a plazmidy inkubovány společně při tělesné teplotě po dobu asi 12 hodin. Buňky absorbují část plazmidů a zacházejí s nimi jako s vlastní plazmidovou DNA.

Sklizeň klonované DNA a proteinů: Většina plazmidů používaných pro klonování DNA má geny rezistence na antibiotika začleněny do jejich DNA. Jelikož bakteriální buňky absorbují nové plazmidy, stávají se rezistentními vůči antibiotikům.

Když je kultura ošetřena antibiotiky, přežijí pouze ty buňky, které absorbovaly nové plazmidy. Výsledkem je čistá kultura bakteriálních buněk s klonovanou DNA. Tato DNA může být poté sklizena nebo může být vyroben odpovídající protein.

The PCR metoda je jednodušší a kopíruje stávající DNA na místě. Nevyžaduje řezání restrikčními enzymy ani vkládání plazmidDNA sekvence. Díky tomu je obzvláště vhodný pro klonování vzorků DNA s omezeným počtem řetězců DNA. Metoda může klonovat DNA, ale nelze ji použít k produkci odpovídajícího proteinu.

Odvíjení řetězců DNA: DNA v chromozomech je pevně svinuta do struktury dvojité šroubovice. Zahřátí DNA na 96 stupňů Celsia v procesu zvaném denaturace dělá molekulu DNA odvinutou a rozdělenou na dva řetězce. Tato separace je nutná, protože najednou lze klonovat pouze jeden řetězec DNA.

Výběr primerů: Stejně jako u klonování plazmidového vektoru DNA je třeba identifikovat sekvence DNA, které mají být klonovány, se zvláštním důrazem na počátky a konce segmentů DNA. Primery jsou enzymy, které se vážou ke specifickým sekvencím kódu DNA a je třeba je vybrat k označení cílových segmentů DNA. Správné primery se připojí k sekvencím molekul DNA, aby označily začátky a konce cílových segmentů.

Žíhání reakce k navázání primerů: Reakce se ochladí na asi 55 stupňů Celsia žíhání. Jak se reakce ochladí, primery se aktivují a připojí se k řetězci DNA na každém konci cílového segmentu DNA. Primery fungují pouze jako markery a řetězec DNA nemusí být řezán.

Produkce identických kopií cílového segmentu DNA: V procesu zvaném rozšíření, se k reakci přidá tepelně citlivý TAQ polymerázový enzym. Reakce se poté zahřeje na 72 stupňů Celsia, čímž se aktivuje enzym. Aktivní enzym DNA polymerázy se váže na primery a kopíruje sekvenci DNA mezi nimi. Počáteční proces sekvenování a klonování DNA je dokončen.

Zvýšení výtěžku klonované DNA: Počáteční proces žíhání a extenze vytváří relativně málo kopií dostupných segmentů řetězce DNA. Aby se zvýšil výtěžek další replikací DNA, reakce se znovu ochladí, aby se znovu aktivovaly primery a nechaly se vázat na další řetězce DNA.

Poté opětovné zahřátí reakce znovu aktivuje polymerázový enzym a vytvoří se více kopií. Tento cyklus lze opakovat 25 až 30krát.

Metoda plazmidového vektoru závisí na dostatečném počátečním přísunu DNA pro štěpení a vložení do plazmidů. Příliš málo původní DNA má za následek méně plazmidů a pomalý start produkce klonovaných DNA.

Metoda PCR může produkovat velké množství DNA z několika původních řetězců DNA, ale protože DNA není implantována do bakteriální buňky, produkce proteinu není možná.

K produkci proteinu kódovaného ve fragmentech DNA, které mají být klonovány, z malého počátečního vzorku DNA, lze tyto dvě metody použít společně a mohou navzájem se doplňují. Nejprve se metoda PCR používá ke klonování DNA z malého vzorku a produkci mnoha kopií.

Pak se produkty PCR používají metodou plazmidového vektoru k implantaci vyrobené DNA do bakteriálních buněk, které budou produkovat požadovaný protein.

Molekulární biologie využívá klonování genů a replikaci DNA pro lékařské a komerční účely. Bakterie s klonovanými sekvencemi DNA se používají k výrobě léčivých přípravků a nahrazují látky, které si lidé s genetickými poruchami nemohou sami vyrobit.

Typická použití zahrnují:

• Gen pro lidský inzulin je klonován v bakteriích, které pak produkují inzulín používaný diabetiky.
• Aktivátor tkáňového plazminogenu se vyrábí z klonované DNA a používá se jako pomoc zabránit vzniku krevních sraženin.
• Lidský růstový hormon mohou být vyráběny a podávány lidem, kteří si to sami nemohou vyrobit.

Biotechnologie také využívá klonování genů v zemědělství k vytváření nových charakteristik rostlin a živočichů nebo ke zlepšení stávajících charakteristik. Jak je klonováno více genů, počet možných použití exponenciálně roste.

Molekuly DNA tvoří malou část materiálu v živé buňce a je obtížné izolovat vlivy mnoha genů. Metody klonování DNA dodávají pro studium velké množství specifické sekvence DNA a DNA produkuje proteiny stejně jako v původní buňce. Klonování DNA umožňuje studovat tuto operaci pro různé geny izolovaně.

Typické aplikace výzkumu a technologií DNA zahrnují zkoumání:

• Funkce genu.
• Mutace genu.
• Genový výraz.
• Genové produkty.
• Genetické vady.

Když je klonováno více sekvencí DNA, je snazší najít a klonovat další sekvence. Existující klonované segmenty DNA lze použít k určení, zda nový segment odpovídá starému a které části se liší. Identifikace cílové sekvence DNA je pak rychlejší a přesnější.

v genová terapie, klonovaný gen je prezentován buňkám organismu, jehož přirozený gen je poškozen. Životně důležitý gen, který produkuje protein potřebný pro funkci konkrétního organismu, může být mutován, změněn radiací nebo ovlivněn viry.

Když gen nefunguje správně, v buňce chybí důležitá látka. Genová terapie se snaží nahradit gen klonovanou verzí, která bude produkovat požadovanou látku.

Genová terapie je stále experimentální a pomocí této techniky bylo vyléčeno jen málo pacientů. Problémy spočívají v identifikaci jediného genu odpovědného za zdravotní stav a dodávání mnoha kopií genu do správných buněk. Vzhledem k tomu, že klonování DNA se rozšířilo, byla genová terapie aplikována v několika konkrétních situacích.

Mezi poslední úspěšné aplikace patří:

• Parkinsonova choroba: Pomocí viru jako vektoru byl do středních mozků pacientů injikován gen související s Parkinsonovou chorobou. Pacienti zaznamenali zlepšenou motoriku bez nežádoucích vedlejších účinků.
• Nedostatek adenosindeaminázy (ADA): Genetická imunitní porucha byla léčena odstraněním krevních kmenových buněk pacientů a vložením genu ADA. Výsledkem bylo, že pacienti byli schopni vyrobit alespoň část své vlastní ADA.
• Hemofilie: Lidé s hemofilií neprodukují specifické proteiny, které pomáhají srážení krve. Do jaterních buněk pacientů byl vložen gen pro produkci jednoho z chybějících proteinů. Pacienti produkovali bílkoviny a krvácení bylo sníženo.

Genová terapie je jednou z nejslibnějších aplikací klonování DNA, ale další nová použití se pravděpodobně budou množit, protože bude studováno více sekvencí DNA a bude stanovena jejich funkce. Klonování DNA dodává surovinu pro genetické inženýrství v potřebném množství.

Když je známa role genů a jejich správná funkce může být zajištěna výměnou vadných geny, mnoho chronických onemocnění a dokonce i rakovina mohou být napadeny a léčeny na genetické úrovni pomocí DNA technologie.

Související obsah:

• Charakteristika kolonií E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Definice, funkce, struktura