Výhody a nevýhody Western Blot

Western blot, analytická technika používaná k určení konkrétního proteinu v daném vzorku, využívá schopnost enzymu nebo fluorescenčně značené primární protilátky vázat se na svůj specifický antigen. Jedná se o tříkrokový proces počínaje gelovou elektroforézou, následovaný blotováním membrány a sondováním pomocí protilátek. Detekce bílkovin může být přímá nebo nepřímá, přičemž druhá používá značenou sekundární protilátku namířenou proti primární. Ačkoli je Western blot akceptován jako rutinní technika analýzy proteinů, má svá omezení i výhody.

Jedním z největších argumentů ve prospěch western blotu je jeho citlivost. Díky své schopnosti detekovat ve vzorku jen 0,1 nanogramu proteinu může technika teoreticky sloužit jako efektivní nástroj včasné diagnostiky, který snímá i sebemenší imunogenní reakci viru nebo bakterie u pacienta vzorek. Nepřímá Western blot dále staví na této citlivosti ze schopnosti sekundární protilátky zesílit intenzitu signálu detekovaného zobrazovacím systémem. Vyšší citlivost znamená, že pro testování je zapotřebí méně protilátek, což výrazně snižuje laboratorní náklady.

Technika western blot vděčí za svou specifičnost dvěma velkým přispívajícím faktorům. Nejprve gelová elektroforéza roztřídí vzorek na proteiny různé velikosti, náboje a konformace. Tento proces je sám o sobě velkým krokem k detekci, protože pruhy vytvořené v gelu již poskytují vodítka o velikosti požadovaného proteinu nebo polypeptidu. Specifičnost interakce protilátka-antigen slouží jako druhý velký faktor. Protože specifické protilátky vykazují afinitu ke specifickým proteinům, může proces selektivně detekovat cílový protein i ve směsi 300 000 různých proteinů.

I přes svoji citlivost a specifičnost může western blot stále přinést chybné výsledky. Falešně pozitivní výsledky, když protilátka reaguje s nezamýšleným proteinem, což je často se stane, když má pacient, který je testován na HIV, tuberkulózu nebo více parazitů infekce. Falešně negativní, na druhé straně, může snadno vzniknout, pokud větší proteiny nedostanou dostatek času na správný přenos na membránu. Nesprávné blotování a zpracování často způsobí zkosení, vyblednutí nebo dokonce více pásem, což výsledky testu podřídí interpretaci technika.

Cena Western blotu je složena z velkých individuálních výdajů na značené protilátky, zkušených analytiků a laboratorního vybavení. Delikátní proces, western blot vyžaduje přesnost v každém kroku pro správnou identifikaci složek vzorku. Drobná chyba v koncentraci činidla nebo v inkubační době může být katastrofální pro celý proces. A konečně, vybavení potřebné pro detekci a zobrazování - chemiluminiscenční, fluorescenční, radioaktivní nebo laserové detekční systémy - může být pro průměrnou mikrobiologickou jednotku příliš drahé.