Jak se sbírá vzorek DNA a připravuje se na studium

Než mohou vědci sekvenovat DNA nebo ji změnit pomocí genetického inženýrství, musí ji nejprve izolovat. To se může zdát jako obtížný úkol, protože buňky obsahují celou řadu dalších sloučenin, jako jsou bílkoviny, tuky, cukry a malé molekuly. Biologové naštěstí mohou využít chemických vlastností DNA k oddělení DNA od těchto kontaminantů a připravit ji pro další studium. Tento proces se nazývá extrakce DNA.

Pro extrakci DNA se používá mnoho různých technik. Ten, který používá jednotlivá laboratoř, závisí na typu experimentu, který má být proveden, a na tom, jak čistá musí být DNA. Vědci obvykle začínají vzorkem obsahujícím buňky - například vzorkem tkáně nebo krve - a buňky rozbijí nebo je lyžují. Existuje řada způsobů, jak můžete lyžovat buňky. Přidání čisticího prostředku způsobí jejich rozpad, stejně jako vystavení vysokofrekvenčním zvukovým vlnám. Alternativně smícháním vzorku se skleněnými kuličkami a rychlým vibracím se buňky fyzicky rozbijí a uvolní se jejich obsah.

Pokud není vyžadována vysoká čistota, mohou vědci přidat enzym zvaný proteináza K, aby rozložil většinu proteinů ve vzorku, a použít jej tak, jak je. Tato technika je však velmi špinavá, protože většina kontaminantů je stále přítomna, takže je vhodná, pouze pokud je prioritou rychlost a čistota není problém. Dalším rychlým a špinavým přístupem je odstranění proteinů zvýšením koncentrace solí přidáním solí, jako je octan amonný nebo octan draselný, k vynucení srážení proteinů. I tato technika je poměrně špinavá, protože stále existuje mnoho dalších kontaminujících látek.

Dalším přístupem je lýza buněk detergentem, poté se roztok smíchá s isoamylalkoholem, chloroformem a fenolem. Roztok se poté rozdělí na dvě vrstvy. Proteiny končí v horní organické vrstvě, zatímco DNA zůstává ve spodní vodné vrstvě. Tato technika vyžaduje pro dobré výsledky pečlivou kontrolu koncentrace soli a pH. Je to časově náročné a fenol i chloroform jsou vysoce toxické chemikálie. V důsledku toho, zatímco extrakce fenol-chloroformem byly kdysi rutinní, v posledních letech se staly populárnější jiné techniky.

Aniontoměničová chromatografie nabízí vyšší čistotu a konzistentnější výsledky než extrakce fenol-chloroformem. Trubice nebo kolona je naplněna malými částicemi, které mají na sobě pozitivně nabitá místa, kde se může vázat negativně nabitá molekula nebo anion. DNA se váže na tato místa pro aniontovou výměnu, zatímco jiné kontaminanty, jako jsou proteiny a RNA, jsou z kolony odplaveny. Později se roztok bohatý na sůl použije k odtržení DNA z kolony.

Nejrychlejší a možná nejspolehlivější technikou čištění DNA je použití speciálně vyrobené soupravy. Tyto soupravy obsahují membrány silikagelu v tubě. DNA se drží na membráně, zatímco jiné kontaminanty jsou odplavovány pomocí řady speciálně připravených solných roztoků, které jsou součástí soupravy. Nakonec se DNA z kolony promyje roztokem s nízkým obsahem soli. Tyto sady jsou rychlé, snadno použitelné a nabízejí reprodukovatelné výsledky.

Jakmile byla DNA izolována a resuspendována v pufrovaném roztoku s řízeným pH, posledním krokem je testování její čistoty. Snadný a pohodlný způsob, jak toho dosáhnout, je zkontrolovat, kolik ultrafialového světla absorbuje při vlnové délce 260 a 280 nanometrů. Absorpce při 260 nanometrech dělená absorpcí při 280 nanometrech by se měla rovnat 1,8, pokud je DNA čistá. Měření absorbance při 260 nanometrech vám také umožňuje určit koncentraci DNA.