Nevýhody západního blotu

Western blot je jedním z nejběžnějších postupů v biochemických laboratořích. V zásadě odděluje proteiny od vzorku podle velikosti a poté testuje pomocí protilátek k určení, zda je daný protein přítomen. Je užitečný nejen ve výzkumu, ale také v lékařských nebo diagnostických laboratořích; testy na HIV i na lymskou boreliózu zahrnují například test ELISA (Enzym Enhanced Immunosorbent Assay), následovaný Western blotem, pokud je test ELISA pozitivní. Navzdory své popularitě má však Western blot několik nevýhod.

Klasické západní bloty nejsou kvantitativní. Jinými slovy, i když mohou vědcům říci, zda je konkrétní protein přítomen, neumožňují kvantifikovat, jaké množství proteinu je přítomen. Některé biotechnologické společnosti nyní prodávají soupravy, které umožňují výzkumníkům nebo laboratorním technikům kvantifikovat jejich množství protein přítomný pomocí standardní křivky - ale to funguje, pouze pokud jsou k dispozici čisté vzorky stejného proteinu k dispozici. Kromě toho lze molekulovou hmotnost proteinu odhadnout pouze pomocí Western blotu, spíše než přesně určit pomocí hmotnostní spektrometrie.

Western blot lze provést, pouze pokud jsou k dispozici primární protilátky proti sledovanému proteinu. I když jsou protilátky proti mnoha různým proteinům k dispozici od biotechnologických společností, nejsou levné; pokud pro daný protein nejsou k dispozici primární protilátky, nebude možné provést Western blot hledající tento konkrétní protein. Vědci navíc mohou chtít zjistit, zda byl protein nějakým způsobem upraven - pokud byl fosforylován (měl a například fosfátová skupina) - a pomocí techniky Western blot potřebují protilátky specifické pro modifikované protein.

Může být náročné provést Western blot správně a dosáhnout dobrých výsledků, takže zaměstnanci musí být dobře vyškoleni. V tomto, stejně jako v mnohem jiném, je zkušenost možná nejlepším tutorem; i pro zkušeného technika je však Western blot časově náročný. Například část experimentu s gelovou elektroforézou bude obvykle trvat jednu až dvě hodiny. Samozřejmě lze provádět i jiné úkoly, zatímco gel běží, ale získání výsledků trvá stále poměrně dlouho.

Protilátky mohou někdy vykazovat určitou mimo cílovou vazbu, což může vést k horším výsledkům. Navíc při Western blotu používáte protilátku proti konkrétnímu proteinu, takže vaše výsledky vám řeknou, pouze pokud byl tento protein přítomen. Hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením naopak odhaluje všechny proteiny přítomné ve vzorku a na rozdíl od klasického Western blotu je kvantitativní. Je důležité si uvědomit, samozřejmě, že hmotnostní spektrometrie je mnohem dražší a také technicky náročnější na použití ve srovnání se západním blotem.