Gelová elektroforéza s dodecylsulfát-polyakrylamidem sodným (SDS-PAGE) je biochemická metoda identifikace proteinů v roztoku. Jak ilustrují Mathews a kol. V „Biochemistry“, vzorky proteinu se nejprve naplní do „jamek“ nebo otvorů na jednom konci polyakrylamidového gelového bloku. Poté se na gel aplikuje elektrické pole. SDS, přidaný k naloženým vzorkům, neguje přirozený náboj proteinů. Z tohoto důvodu samotná molekulová hmotnost proteinu určuje rychlost migrace proteinů při jejich pohybu gelem směrem ke kladně nabitému pólu, uvádí Bitesize Bio. Více proteinů ve stejném vzorku se proto od sebe oddělí a migruje do různých pozic.
Orientujte gelovou fotografii. „Nahoře“ je umístění jamek, kde byly původně přidány vzorky. „Dno“ je místo, kde vzorky migrovaly směrem k a nejčastěji obsahují přední část barviva, která označuje migrující přední část vzorků. Levá nebo pravá strana by měla obsahovat „značku“, která slouží jako předvídatelný průvodce molekulovou hmotností.
Označte vzorky pro každý pruh. V horní části budou vzorky přidané do jamek migrovat vertikálně v „pruzích“. Proto všechny pruhy viditelné ve svislém sloupci pocházely z jednoho vzorku načteného přímo nad ním. Pokud je obtížné vizualizovat sloupce, použijte pravítko a pero k ohraničení pruhů.
Označte velikosti molekul pásů v pruhu značky. Komerčně dostupné markery přicházejí s obrázkem vzoru pásu, který lze očekávat, spolu s molekulovými hmotnostmi každého pásma. Pásy jsou tmavé horizontální „pruhy“, které jsou ve skutečnosti obarveným proteinem zabudovaným do gelu.
Nakreslete světlé vodorovné čáry vyčnívající z každého pruhu značky k opačnému okraji gelu. Dávejte pozor, aby tyto čáry byly rovnoběžné s jamkami a přední částí barviva. Tyto čáry označují, kde by proteiny o molekulové hmotnosti indikované každým z pruhů markerů byly umístěny v každé dráze. Například pásmo v jízdním pruhu 4, které se nachází těsně pod linkou, vyčnívající z 25 kilodaltonů značkovací pásek by naznačoval, že pás 4. pruhu je molekulárně téměř, ale ne zcela 25 kilodaltonů hmotnost.
Každé pásmo v každé dráze označte odhadovanou molekulovou hmotností. Značky používejte jako vodítko a odhadujte hodnoty mezi velikostmi značek.
Pod gelovou fotografii vytvořte seznam „proteinů“ pro každý pruh. Začněte uvedením toho, co je o každém vzorku známo, například jeho původ nebo podmínky. Poté uveďte odhadovanou molekulovou hmotnost každého pásma v pruhu. Dráhy s jedním pruhem naznačují, že vzorek obsahuje pouze jeden protein. Dráhy s více pruhy indikují přítomnost více proteinů. Pásma, která běží s frontou migrace, jsou menší, než navrhuje nejbližší značka, a pravděpodobně je nelze předvídat, kromě případů, kdy značka označuje „menší než“.
V seznamu proteinů si všimněte zvláštností. „Rozmazaný“ vzhled může naznačovat, že je přítomno příliš mnoho proteinů nebo že viskozita vzorku ovlivnila jeho migraci. okraj pruhu nebo jsou ve srovnání s jinými pásy poměrně velké, pak je koncentrace tohoto proteinu pravděpodobně příliš vysoká a měla by být v budoucnu zředěna elektroforéza. Šedivý odstín v celém pruhu, tmavší než barva pozadí gelu, naznačuje nerozeznatelné fragmenty proteinů.
Určete identitu proteinů v každém pruhu. Ačkoli se to děje pouze s použitím molekulové hmotnosti, zdroj každého pruhu bude pravděpodobně indikovat také stopy. Vezměte v úvahu, že za určitých podmínek mohou proteiny udržovat asociaci dimeru nebo trimeru na gelu. Jeden protein se proto může na gelu objevit jako tři odlišné pruhy. I když proteiny nelze identifikovat, relativní temnota pásů může znamenat koncentrace proteinů v roztoku. Jakékoli zvědavé a neznámé proteiny lze izolovat přímo z původního gelu a odeslat k identifikaci.
Věci, které budete potřebovat
- Fotografie gelu SDS-PAGE, obarvená
- Klíč pro použitý marker molekulové hmotnosti
- Pravítko
- Pero