Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) je laboratorní technika používaná k oddělení a identifikaci sloučenin. Jedná se o typ sloupcové chromatografie, který se spoléhá na různé polarity sloučenin v roztoku, aby je mohl oddělit. HPLC se liší od standardní sloupcové chromatografie, protože používá tlak k rychlejšímu protlačení roztoku kolonou, a proto poskytuje rychlejší a někdy i přesnější výsledky. Cílem je oddělit sloučeniny ve sloupci a nechat je samostatně opustit.
Vzhledem k rychlosti HPLC a spoléhání se na různé polarity sloučenin, dvě sloučeniny s podobná struktura a polarity mohou opustit chromatografický přístroj současně nebo téměř stejně čas. Toto se nazývá koelutace. Díky koelutaci je obtížné přesně určit, která část směsi se v daném okamžiku eluuje.
HPLC obvykle používá skleněnou kolonu naplněnou kuličkami vyrobenými z různých materiálů. Směsi vytlačované kolonou obsahují chemikálie, které se na kuličky váží s různou silou. Síla vazby, která závisí na podobnosti polarity, určuje, jak dlouho se chemická látka naváže na perličku před uvolněním. Některé sloučeniny se vážou tak silně, že se v podstatě nikdy neuvolňují z kuliček ve sloupci a nikdy se neměřují v roztoku opouštějícím sloupec.
Typické laboratorní separační techniky zahrnují vývoj testu nebo metody separace a následné provedení tohoto testu k oddělení jednotlivých sloučenin od roztoku. To však obvykle vede k několika řešením, která také musí podstoupit procedury, což vede k exponenciálnímu zvýšení složitosti. Ačkoli HPLC může tento proces často zjednodušit a urychlit, náklady na vývoj zařízení pro HPLC se mohou stát obrovskými. Vývoj zařízení pro HPLC, i když je mnohem účinnější, je mnohem nákladnější než vývoj jiných testů pro separaci sloučenin. Díky tomu není pro mnoho malých soukromých laboratoří finančně životaschopný.
HPLC se nepoužívá pouze k oddělení jednoduchých sloučenin, ale také se používá k izolaci specifických proteinů z buněčné směsi. V tomto případě jsou kuličky ve sloupci obvykle potaženy protilátkou specifickou pro protein, který potřebujete shromáždit. Proteiny váží protilátky a zbývající roztok prochází kolonou, poté se proteiny uvolňují pomocí jiného roztoku a shromažďují se. To vyžaduje, aby vysoce kvalifikovaný technik neustále sledoval sloupec a ujistil se, že proces běží přesně podle plánu.
