ДНК клониране: Определение, процес, примери

Възможно е да се клонират цели организми като овцата Доли, но клонирането на ДНК е различно. Той използва техники за молекулярна биология, за да направи идентични копия на ДНК последователности или единични гени.

Използвайки методи за генно инженерство, се идентифицират и изолират сегменти от генетичния код на ДНК. След това ДНК клонирането копира нуклеинова киселина последователности в сегментите.

Получените идентични копия могат да се използват за по-нататъшни изследвания или за биотехнологични приложения. Често копираният ген кодира протеин, който може да бъде част от медицинското лечение. ДНК технология включително ДНК клониране подкрепя разбирането за това как работят гените и как генетичният код на хората влияе върху функционирането на тялото.

ДНК клонирането е процесът на молекулярна биология за създаване на идентични копия на ДНК сегменти, разположени в хромозомите, които съдържат генетичния код на напредналите организми.

Процесът генерира големи количества от

Извикват се двата метода, използвани при клонирането на ДНК плазмиден вектор и полимеразна верижна реакция (PCR). В плазмиден вектор метод, ДНК веригите се изрязват с помощта рестрикционни ензими за да се получат ДНК фрагменти и получените сегменти се вмъкват във вектори за клониране, наречени плазмиди за по-нататъшно дублиране. Плазмидите се поставят в бактериални клетки, които след това произвеждат ДНК копия или кодирани протеини.

В PCR метод, сегментът от ДНК вериги, които трябва да се дублират, е маркиран с ензими, наречени грундове. Ензимът на полимеразата прави копия на маркираната част от ДНК веригата. Този метод не използва рестрикционни ензими и може да произведе клонирана ДНК от малки проби. Понякога двата ДНК технологични метода се използват заедно, за да се включат най-добрите характеристики на всеки от тях в цялостната реакция.

Векторът на метода се отнася до плазмида, използван за задържане на целевия ДНК сегмент за клониране. Плазмидите са малки кръгли нишки от нехромозомна ДНК намира се в много организми, включително бактерии и вируси.

Бактериалните плазмиди са векторът, използван за вмъкване на целевия ДНК сегмент в бактериални клетки за по-нататъшно дублиране.

Избор и изолиране на целевата ДНК: Преди да започне процесът на клониране на ДНК, ДНК последователностите трябва да бъдат идентифицирани, особено началото и краищата на ДНК сегментите.

Такива ДНК последователности могат да бъдат намерени чрез използване на съществуваща клонирана ДНК с известни последователности или чрез изучаване на протеина, произведен от целевата ДНК последователност. След като последователността е известна, могат да се използват съответните рестрикционни ензими.

Нарязване на целевата ДНК с рестрикционни ензими: Рестрикционните ензими са избрани, за да се търси ДНК кодът в началото и в края на целевите последователности.

Когато рестрикционните ензими открият специална кодирана последователност от базови двойки, наречени рестрикционни сайтове, те привързват се към ДНК на това място и се навиват около молекулата на ДНК, разкъсвайки направление. Изрязаните ДНК сегменти, съдържащи целевата последователност, вече са достъпни за дублиране.

Избор на плазмиден вектор и вмъкване на целевата ДНК: Подходящият плазмид в идеалния случай съдържа същите ДНК кодиращи последователности като ДНК веригата, от която е изрязана целевата ДНК. Кръговата ДНК верига на плазмида се изрязва със същите рестрикционни ензими, както са били използвани за изрязване на целевата ДНК.

A ДНК лигазен ензим се използва за насърчаване на свързването на ДНК сегмент и краищата на целевия ДНК сегмент се свързват с изрязаните краища на плазмидната ДНК. ДНК целта сега формира част от кръговата плазмидна ДНК верига.

Поставяне на плазмида в бактериална клетка: След като плазмидът съдържа ДНК последователността, която трябва да се клонира, действителното клониране може да се осъществи с помощта на процес, наречен бактериална трансформация. Плазмидите се вкарват в бактериална клетка като Е. coli и клетките с новите ДНК сегменти ще започнат да произвеждат копия и съответните протеини.

При бактериална трансформация клетките гостоприемници и плазмидите се инкубират заедно при телесна температура за около 12 часа. Клетките абсорбират част от плазмидите и ги третират като своя собствена плазмидна ДНК.

Събиране на клонирана ДНК и протеини: Повечето плазмиди, използвани за клониране на ДНК, имат гени за резистентност към антибиотици включени в тяхната ДНК. Тъй като бактериалните клетки абсорбират новите плазмиди, те стават устойчиви на антибиотици.

Когато културата се третира с антибиотици, оцеляват само онези клетки, които са абсорбирали новите плазмиди. Резултатът е чиста култура от бактериални клетки с клонирана ДНК. След това тази ДНК може да бъде събрана или да бъде произведен съответният протеин.

The PCR методът е по-опростен и копира съществуващата ДНК на място. Не изисква рязане с рестрикционни ензими или вмъкване плазмидДНК последователности. Това го прави особено подходящ за клониране на ДНК проби с ограничен брой ДНК вериги. Докато методът може да клонира ДНК, той не може да се използва за производството на съответния протеин.

Разкриване на ДНК веригите: ДНК в хромозомите е плътно навита в структура с двойна спирала. Нагряване на ДНК до 96 градуса по Целзий в процес, наречен денатурация кара молекулата на ДНК да се развие и да се отдели на две вериги. Това разделяне е необходимо, тъй като само една верига ДНК може да бъде клонирана едновременно.

Избиране на грундовете: Както при клонирането на ДНК на плазмиден вектор, ДНК последователностите, които трябва да се клонират, трябва да бъдат идентифицирани със специален акцент върху началото и краищата на ДНК сегментите. Праймерите са ензими, които се прикрепят към специфични ДНК кодови последователности и те трябва да бъдат избрани, за да маркират целевите ДНК сегменти. Правите праймери ще се прикрепят към ДНК молекулните последователности, за да отбележат началото и краищата на целевите сегменти.

Отгряване на реакцията за свързване на праймерите: Призовава се охлаждане на реакцията до около 55 градуса по Целзий отгряване. Когато реакцията се охлади, праймерите се активират и се прикрепват към ДНК веригата във всеки край на целевия ДНК сегмент. Праймерите действат само като маркери и ДНК веригата не трябва да се реже.

Производство на идентични копия на целевия ДНК сегмент: В процес, наречен удължаване, към реакцията се добавя термочувствителният ензим TAQ полимераза. След това реакцията се загрява до 72 градуса по Целзий, активирайки ензима. Активният ДНК полимеразен ензим се свързва с праймерите и копира ДНК последователността между тях. Първоначалният процес на секвениране и клониране на ДНК е завършен.

Увеличаване на добива на клонирана ДНК: Първоначалният процес на отгряване и удължаване създава относително малко копия на наличните сегменти на ДНК веригата. За да се увеличи добива чрез допълнителна репликация на ДНК, реакцията се охлажда отново, за да активира отново праймерите и да ги остави да се свързват с други ДНК вериги.

След това, повторното нагряване на реакцията активира отново полимеразния ензим и се получават повече копия. Този цикъл може да се повтори 25 до 30 пъти.

Методът на плазмидния вектор разчита на достатъчно първоначално снабдяване с ДНК, за да се изреже и вмъкне в плазмидите. Твърде малко оригинална ДНК води до по-малко плазмиди и бавен старт за клониране на производството на ДНК.

Методът PCR може да произведе голямо количество ДНК от няколко оригинални ДНК вериги, но тъй като ДНК не се имплантира в бактериална клетка, производството на протеини не е възможно.

За да се произведе протеинът, кодиран в ДНК фрагментите, който да се клонира от малка първоначална ДНК проба, двата метода могат да се използват заедно и те могат взаимно се допълват. Първо методът PCR се използва за клониране на ДНК от малка проба и получаване на много копия.

След това PCR продуктите се използват с метода на плазмидния вектор за имплантиране на произведената ДНК в бактериални клетки, които ще произведат желания протеин.

Молекулярната биология използва клониране на гени и репликация на ДНК за медицински и търговски цели. Бактериите с клонирани ДНК последователности се използват за производство на лекарства и заместване на вещества, които хората с генетични заболявания не могат да произведат сами.

Типичните приложения включват:

• Генът за човешки инсулин е клониран в бактерии, които след това произвеждат инсулин, използван от диабетици.
• Тъканният плазминогенен активатор се произвежда от клонирана ДНК и се използва в помощ предотвратяват образуването на кръвни съсиреци.
• Човешки растежен хормон може да се произвежда и администрира на хора, които не могат да го произведат сами.

Биотехнологиите също използват клониране на гени в селското стопанство, за да създадат нови характеристики в растенията и животните или да подобрят съществуващите характеристики. С клонирането на повече гени броят на възможните употреби се увеличава експоненциално.

ДНК молекулите съставляват малка част от материала в живата клетка и е трудно да се изолират влиянията на многото гени. Методите за клониране на ДНК доставят големи количества от специфична ДНК последователност за изследване и ДНК произвежда протеини, точно както в оригиналната клетка. ДНК клонирането дава възможност да се изследва тази операция за различни гени изолирано.

Типичните изследователски и ДНК технологични приложения включват изследване:

• Функция на ген.
• Мутации на ген.
• Генната експресия.
• Генни продукти.
• Генетични дефекти.

Когато се клонират повече ДНК последователности, е по-лесно да се намерят и клонират допълнителни последователности. Съществуващите клонирани ДНК сегменти могат да се използват, за да се определи дали нов сегмент съответства на стария и кои части са различни. Тогава идентифицирането на целева ДНК последователност е по-бързо и по-точно.

В генна терапия, клониран ген се представя на клетките на организъм, чийто естествен ген е повреден. Жизненоважен ген, който произвежда протеин, необходим за специфична функция на организма, може да бъде мутиран, променен от радиация или засегнат от вируси.

Когато генът не работи правилно, в клетката липсва важно вещество. Генната терапия се опитва да заменете гена с клонирана версия, която ще произведе необходимото вещество.

Генната терапия все още е експериментална и малко пациенти са излекувани с помощта на техниката. Проблемите се крият в идентифицирането на единичния ген, отговорен за медицинското състояние, и доставянето на много копия на гена до правилните клетки. Тъй като клонирането на ДНК става все по-широко, генната терапия се прилага в няколко специфични ситуации.

Последните успешни приложения включват:

• Болестта на Паркинсон: Използвайки вирус като вектор, ген, свързан с болестта на Паркинсон, се инжектира в средния мозък на пациентите. Пациентите са имали подобрени двигателни умения без никакви нежелани странични ефекти.
• Дефицит на аденозин дезаминаза (ADA): Генетично имунно разстройство се лекува чрез премахване на кръвните стволови клетки на пациентите и вмъкване на гена ADA. В резултат на това пациентите успяха да произведат поне част от собствената си ADA.
• Хемофилия: Хората с хемофилия не произвеждат специфични протеини, които помагат за съсирването на кръвта. Ген за производството на един от липсващите протеини е вмъкнат в чернодробните клетки на пациентите. Пациентите, произвеждащи протеин, и инцидентите с кървене са намалени.

Генната терапия е едно от най-обещаващите приложения за клониране на ДНК, но други нови приложения вероятно ще се размножават, тъй като се изследват повече ДНК последователности и се определя тяхната функция. ДНК клонирането доставя суровината за генно инженерство в необходимите количества.

Когато ролята на гените е известна и тяхната правилна функция може да бъде осигурена чрез заместване на дефектни гени, много хронични заболявания и дори рак могат да бъдат атакувани и лекувани на генетично ниво с помощта на ДНК технология.

Свързано съдържание:

• Характеристики на колонията на E.Coli (Escherichia Coli)
• РНК: Определение, функция, структура