В молекулярната биология може да бъде добър избор на буфер и подготовка за различни етапи на изолиране на ДНК разликата между преминаването към експресия на протеин или отварянето на друг комплект за подготовка на макси, за да започнете над. Въпреки решаващото си значение, буферните рецепти често са точно това - рецепти, написани без обяснение или обосновка за различните компоненти. Един такъв буфер е глюкозо-трис-EDTA или GTE буфер.
За какво се използва GTE?
GTE се използва за ресуспендиране на бактериални клетъчни пелети, преди да се лизират (разчупят) клетките и да се събере плазмидната ДНК вътре. Лизозим, който омекотява клетъчните мембрани, често се добавя заедно с GTE буфера. Постигането на хомогенна суспензия на цели клетки по време на този етап, така че добавеният впоследствие разтвор за лизис да може да достигне до всички клетки е от ключово значение за получаване на добри добиви на ДНК. GTE е проектиран да прави това, като същевременно осигурява стабилна среда за ДНК.
Глюкоза за осмоларност
50mM (милимоларна) глюкозна захар се добавя към GTE буфера, за да се поддържа осмоларността, когато концентрацията на разтвореното вещество извън клетките е близка до тази вътре в клетките. Това предотвратява преждевременния лизис на клетките, което може да доведе до по-ниски добиви на ДНК поради агрегиране и разграждане. Другите компоненти на буфера също допринасят за осмоларността на разтвора, но глюкозата, е неелектролит, е добър избор, защото не пречи на буфера на разтвора Имоти.
Трис за рН стабилност
Трис е краткото наименование на трис (хидроксиметил) аминометан, който е много често срещан pH буфер. В случай на GTE буфер, киселинната сол (Tris-HCl) се добавя към буфера при концентрация 25 тМ. Това поддържа рН на разтвора на почти физиологично 8,0, идеално рН за предотвратяване на киселинна хидролиза (разграждане) на плазмидната ДНК и нежелани странични реакции на останалите клетъчни компоненти.
EDTA предотвратява разграждането на ДНК
EDTA или етилендиаминтетраоцетната киселина улавя или "хелатира" метални йони извън разтвора, като им пречи да участват в нежелани странични реакции. В GTE буфер, EDTA се добавя при 10 mM. Основната му цел е в буфера да закръгли свободния цинк, магнезий и калций, като по този начин предотвратява разграждането на ДНК по определени пътища, които изискват тези метали.
Някои важни съвети
Поддържайте своя GTE буфер студен и го правете в малки количества, за да предотвратите растежа на нежелани бактерии в него. Захарта и контролираното рН създават чудесна среда за растеж. Винаги използвайте пречистена вода. Водата от чешмата може да има излишък от метални йони от тръбите, което може да преодолее способността на EDTA да улавя. Ако подозирате наличието на смущаваща РНК във вашата проба, добавете RNase A при 100 микрограма на милилитър към вашия GTE буфер, за да премахнете проблема.