ДНК секвениране: Определение, методи, примери

Нуклеотидите са химическите градивни елементи на живота и се намират в ДНК на живите организми. Всеки нуклеотид се състои от захар, фосфат и а азотсъдържаща основа: аденин (А), тимин (Т), цитозин (С) и гуанин (G). Специфичният ред на тези нуклеотидни основи определя кои протеини, ензими и молекули ще бъдат синтезирани от клетката.

Определянето на реда или последователността на нуклеотидите е важно за изучаването на мутации, еволюция, прогресиране на болестта, генетични тестове, съдебномедицински изследвания и медицина.

Геномика е изследването на ДНК, гените, взаимодействията между гените и влиянието на околната среда върху гените. Тайната за разкриване на сложната вътрешна работа на гените е способността да се идентифицира тяхната структура и местоположение върху хромозомите.

Планът на живите организми се определя от реда (или последователността) на двойките основи на нуклеинова киселина в ДНК. Когато ДНК се репликира, аденин се сдвоява с тимин и цитозин с гуанин; разглеждат се несъответстващи двойки мутации.

Тъй като двойната спирала Дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) молекула е концептуализирана през 1953 г., направени са драматични подобрения в областта на геномиката и широкомащабното секвениране на ДНК. Учените усърдно работят, за да приложат тези нови знания за индивидуализирано лечение на заболявания.

В същото време продължаващите дискусии позволяват на изследователите да изпреварят етичните последици от такива бързо избухващи технологии.

ДНК секвенирането е процес на откриване на последователността на различни нуклеотидни бази в фрагменти от ДНК. Последователността на цели гени позволява сравнение на хромозоми и геноми, присъстващи в един и същи и различни видове.

Картографирането на хромозомите е полезно за научни изследвания. Анализиране на механизмите и структурата на гени, алели и хромозомни мутации в ДНК молекули предлага нови начини за лечение на генетични нарушения и спиране на раковия туморен растеж, например.

Методи за секвениране на ДНК на Фредерик Сангър значително напредна в областта на геномиката, започвайки през 70-те години. Sanger се чувстваше готов да се справи с секвенирането на ДНК след успешно секвениране на РНК при изучаване на инсулин. Сангер не е първият учен, който се занимава с секвениране на ДНК. Въпреки това, неговите умни методи за секвениране на ДНК - разработени в тандем с колегите Берг и Гилбърт - спечелиха Нобелова награда през 1980 г.

Сангер знаеше потенциалната стойност на работата си и често си сътрудничеше с други учени, които споделяха интересите му към ДНК, молекулярна биология и науката за живота.

Макар и бавни и скъпи в сравнение с днешните технологии за секвениране, методите за секвениране на ДНК на Sanger бяха възхвалявани по това време. След проби и грешки, Сангер намери тайната биохимична „рецепта“ за отделяне на нишки на ДНК, създаване на повече ДНК и определяне на реда на нуклеотидите в генома.

Висококачествени материали могат лесно да бъдат закупени за използване в лабораторни изследвания:

• ДНК полимераза е ензимът, необходим за създаването на ДНК.
• ДНК праймер казва на ензима откъде да започне работа върху ДНК веригата.
• dNTP са органични молекули, изградени от дезоксирибозна захар и нуклеозидни трифосфати - dATP, dGTP, dCTP и dTTP - които събират протеини
• Терминатори за вериги са нуклеотиди с оцветен цвят, наричани още терминаторни нуклеотиди за всяка основа - A, T, C и G.

Сангер измисли как да нарязва ДНК на малки сегменти, използвайки ензима ДНК полимераза.

След това направи повече ДНК от шаблон и вмъкна радиоактивни маркери в новата ДНК, за да разграничи участъци от отделените нишки. Той също така осъзна, че ензимът се нуждае от грунд, който може да се свърже с определено място на веригата на шаблона. През 1981 г. Сангер отново влезе в историята, като разбра генома на 16 000 базови двойки на митохондриалната ДНК.

Температурата трябва да бъде внимателно регулирана по време на процеса на секвениране. Първо, химикалите се добавят в тръба и се нагряват, за да се разнищи (денатурира) двуверижната ДНК молекула. След това температурата се охлажда, което позволява грундът да се слепи.

След това температурата се повишава, за да се насърчи оптималната активност на ДНК полимеразата (ензима).

Полимеразата обикновено използва нормалните налични нуклеотиди, които се добавят при по-висока концентрация. Когато полимеразата стигне до свързан с багрило нуклеотид, свързващ веригата, полимеразата спира и веригата завършва там, което обяснява защо боядисаните нуклеотиди се наричат ​​„завършваща верига“ или „Терминатори“.

Процесът продължава много, много пъти. В крайна сметка свързаният с багрилото нуклеотид е поставен на всяка една позиция на ДНК последователността. След това гел електрофорезата и компютърните програми могат да идентифицират оцветителите на всяка от ДНК веригите и разберете цялата последователност на ДНК въз основа на багрилото, позицията на багрилото и дължината на направления.

Последователност с висока производителност - обикновено се нарича последователност от следващо поколение - използва нови постижения и технологии за секвениране на нуклеотидни бази по-бързо и по-евтино от всякога. Машината за секвениране на ДНК може лесно да се справи с мащабни участъци от ДНК. Всъщност, цели геноми могат да бъдат направени за броени часове, вместо за години с техниките на Sanger за секвениране.

Методите за секвениране от следващо поколение могат да се справят с ДНК анализ с голям обем без добавена стъпка на амплификация или клониране, за да се получи достатъчно ДНК за секвениране. Машините за секвениране на ДНК изпълняват едновременно множество реакции на секвениране, което е по-евтино и по-бързо.

По същество новата технология за секвениране на ДНК изпълнява стотици реакции на Sanger върху малък, лесно четим микрочип, който след това се стартира чрез компютърна програма, която сглобява последователността.

Техниката отчита по-къси фрагменти от ДНК, но все пак е по-бърза и по-ефективна от методите за последователност на Sanger, така че дори мащабни проекти могат да бъдат завършени бързо.

The Проект за човешки геном, завършено през 2003 г., е едно от най-известните изследвания на последователността, направени до момента. Според статия от 2018 г. в Научни новини, човешкият геном се състои от приблизително 46 831 гени, което беше страхотно предизвикателство за последователността. Най-добрите учени от цял ​​свят прекараха почти 10 години в сътрудничество и консултации. Водени от Националното изследване на човешкия геном

Institute, проектът успешно начерта човешкия геном, използвайки съставна проба, взета от анонимни кръводарители.

Проектът за човешкия геном разчита на методите за секвениране на бактериални изкуствени хромозоми (базирани на BAC), за да очертае базовите двойки. Техниката използва бактерии за клониране на ДНК фрагменти, което води до големи количества ДНК за секвениране. След това клонингите бяха намалени по размер, поставени в машина за секвениране и сглобени в участъци, представляващи човешка ДНК.

Новите открития в геномиката променят дълбоко подходите за превенция, откриване и лечение на заболявания. Правителството е отделило милиарди долари за изследвания на ДНК. Органите на реда разчитат на ДНК анализ за решаване на казуси. Комплекти за ДНК тестване могат да бъдат закупени за домашна употреба, за да се изследват предците и да се идентифицират генни варианти, които могат да представляват риск за здравето:

• Геномен анализ предполага сравняване и противопоставяне на геномните последователности на много различни видове в областите и царствата на живота. ДНК секвенирането може да разкрие генетични модели, които хвърлят нова светлина върху еволюционното въвеждане на определени последователности. Предците и миграцията могат да бъдат проследени чрез ДНК анализ и сравнени с исторически записи.

• Напредък в медицината се случват с експоненциална скорост, защото на практика всяко човешко заболяване има генетичен компонент. ДНК секвенирането помага на учените и лекарите да разберат как множество гени взаимодействат помежду си и околната среда. Бързото секвениране на ДНК на нов микроб, причиняващ огнище на болестта, може да помогне за идентифицирането на ефективни лекарства и ваксини, преди проблемът да се превърне в сериозен проблем за общественото здраве. Генните варианти в раковите клетки и туморите могат да бъдат секвенирани и използвани за разработване на индивидуализирани генни терапии.

• Съдебна наука приложения са били използвани, за да помогнат на органите на реда да пробият хиляди трудни дела от края на 80-те години, според Национален институт на правосъдието. Доказателствата на местопрестъплението могат да съдържат проби от ДНК от кост, коса или телесна тъкан, които могат да бъдат сравнени с ДНК профила на заподозрян, за да се определи вината или невинността. Полимеразната верижна реакция (PCR) е често използван метод за копиране на ДНК от следи от доказателства преди секвенирането.

• Секвениране на новооткрити видове може да помогне да се определи кои други видове са най-тясно свързани и да разкрие информация за еволюцията. Таксономистите използват ДНК „баркодове“ за класифициране на организмите. Според Университет на Джорджия през май 2018 г. има около 303 вида бозайници, които тепърва ще бъдат открити.

• Генетично изследване за болести търсете мутирали генни варианти. Повечето са единични нуклеотидни полиморфизми (SNP), което означава, че само един нуклеотид в последователността е променен от „нормалната“ версия. Факторите на околната среда и начинът на живот влияят върху това как и дали се експресират определени гени. Глобалните компании правят модерни технологии за секвениране от ново поколение на разположение на изследователи от цял ​​свят, които се интересуват от многогенетични взаимодействия и секвениране на целия геном.

• ДНК комплекти за генеалогия използвайте ДНК последователности в тяхната база данни, за да проверите за варианти в гените на индивида. Комплектът изисква проба от слюнка или тампон от бузи, които се изпращат до търговска лаборатория за анализ. В допълнение към информацията за родословието, някои комплекти могат да идентифицират единични нуклеотидни полиморфизми (SNP) или други добре известни генетични варианти като гените BRCA1 и BRCA2, свързани с повишен риск за женските гърди и рак на яйчниците.

Новите технологии често идват с възможност за социална полза, както и вреда; примери включват неправилно функциониращи атомни електроцентрали и ядрени оръжия за масово унищожение. ДНК технологиите идват и с рискове.

Емоционалните опасения относно инструментите за секвениране на ДНК и редактиране на гени като CRISPR включват страхове, че технологията може да улесни клонирането на хора или да доведе до мутантни трансгенни животни, създадени от мошеник учен.

По-често етичните въпроси, свързани с последователността на ДНК, са свързани с информирано съгласие. Лесният достъп до тестването на ДНК директно към потребителя означава, че потребителите може да не разбират напълно как тяхната генетична информация ще се използва, съхранява и споделя. Миряните може да не са емоционално готови да научат за техните дефектни генни варианти и рисковете за здравето.

Трети страни като работодатели и застрахователни компании могат потенциално да дискриминират лица, които носят дефектни гени, които могат да доведат до сериозни медицински проблеми.