Предимствата на използването на лепкави ензими

Молекулярното клониране е често срещан биотехнологичен метод, с който всеки студент и изследовател трябва да е запознат. Молекулярно клониране с използване на тип ензим, наречен рестрикционен ензим, за да се нарязва човешка ДНК на фрагменти, които след това могат да бъдат вмъкнати в плазмидната ДНК на бактериална клетка. Рестрикционните ензими намаляват наполовина двуверижната ДНК. В зависимост от рестрикционния ензим, разрезът може да доведе до лепкав или тъп край. Залепващите краища са по-полезни при молекулярното клониране, защото те гарантират, че фрагментът от човешка ДНК се вмъква в плазмида в правилната посока. Процесът на лигиране или сливането на ДНК фрагменти изисква по-малко ДНК, когато ДНК има лепкави краища. И накрая, множество лепкави крайни рестрикционни ензими могат да произведат един и същ лепкав край, въпреки че всеки ензим разпознава различна рестрикционна последователност. Това увеличава вероятността вашата ДНК област, която представлява интерес, да бъде изрязана от лепкави крайни ензими.

Рестрикционните ензими са ензими, които намаляват разпознават специфични последователности на двуверижна ДНК и намаляват ДНК наполовина при тази последователност. Разпознатата последователност се нарича рестрикционно място. Рестрикционните ензими се наричат ​​ендонуклеази, тъй като те режат двуверижна ДНК, по този начин ДНК обикновено съществува, на места, които са между краищата на ДНК. Има повече от 90 различни рестрикционни ензими. Всеки разпознава отделен сайт за ограничение. Рестрикционните ензими разцепват съответните си рестрикционни места 5000 пъти по-ефективно от други сайтове, които те не разпознават.

Рестрикционните ензими се предлагат в два основни класа. Те или нарязват ДНК на лепкави краища, или на тъпи краища. Един лепкав край има къса област от нуклеотиди, градивните елементи на ДНК, която е несдвоена. Този несдвоен регион се нарича надвес. Казва се, че надвесът е лепкав, защото иска и ще се сдвои с друг лепкав край, който има допълнителна последователност на надвесите. Залепващите краища са като отдавна изгубени близнаци, които се стремят да се прегърнат силно, след като се срещнат. От друга страна, тъпите краища не са лепкави, защото всички нуклеотиди вече са сдвоени между двете вериги на ДНК. Предимството на лепкавите краища е, че фрагмент от човешка ДНК може да се побере в бактериален плазмид само в една посока. За разлика от това, ако човешката ДНК и бактериалният плазмид имат тъпи краища, човешката ДНК може да бъде вмъкната глава в опашка или опашка в главата в плазмида.

Въпреки че ДНК с краищата на пръчките се намират по-лесно поради тяхната „лепкавост“, нито лепкавите краища, нито тъпите краища могат да се слеят в непрекъснато парче ДНК. Образуването на непрекъснато парче ДНК, което е напълно свързано, изисква ензим, наречен лигаза. Лигазите свързват гръбнака на нуклеотидите в лепкавите или тъпи краища, което води до непрекъсната верига от нуклеотиди. Тъй като лепкавите краища се намират по-бързо поради привличането си един към друг, процесът на лигиране изисква по-малко човешка ДНК и по-малко плазмидна ДНК. Тъпите краища на ДНК и плазмидите са по-малко склонни да се намерят един друг и по този начин лигирането на тъпи краища изисква повече ДНК да се постави в епруветката.

Местата за ограничение са разположени в целия геном на организмите, но не са равномерно разположени. В плазмидите те могат да бъдат проектирани да бъдат разположени точно един до друг. Учените, които искат да изрежат фрагмент от човешка ДНК от човешкия геном, трябва да намерят места за ограничаване, които са отпред и отзад в областта на фрагмента. В допълнение към гарантирането, че ДНК фрагмент е вмъкнат в правилната посока, различни лепкави крайни ензими могат да създадат един и същ лепкав край, въпреки че разпознават различни рестрикционни последователности. Например BamHI, BglII и Sau3A имат различни последователности на разпознаване, но произвеждат един и същ лепкав край на GATC. Това увеличава вероятността да има лепкави крайни сайтове за ограничаване, които фланкират вашия човешки ген, който ви интересува.