Как се събира проба от ДНК и се подготвя за изследване

Преди да могат да секвенират ДНК или да я променят чрез генно инженерство, учените първо трябва да я изолират. Това може да изглежда трудна задача, тъй като клетките съдържат голямо разнообразие от други съединения като протеини, мазнини, захари и малки молекули. За щастие биолозите могат да използват химичните свойства на ДНК, за да отделят ДНК от тези замърсители и да я подготвят за по-нататъшно проучване. Този процес се нарича екстракция на ДНК.

Има много различни техники, използвани за екстракция на ДНК. Този, използван от отделна лаборатория, зависи от вида на експеримента, който трябва да се извърши, и колко чиста трябва да бъде ДНК. Обикновено учените започват с проба, съдържаща клетки - проба от тъкан или кръв, например - и разбиват клетките или ги лизират. Има различни начини, по които можете да лизирате клетките. Добавянето на препарат ще доведе до тяхното разделяне, както и при излагането им на високочестотни звукови вълни. Като алтернатива, смесването на пробата със стъклени мъниста и нейното бързо вибриране ще раздели физически клетките и ще освободи съдържанието им.

Ако не се изисква висока чистота, учените могат да добавят ензим, наречен протеиназа К, за да разградят повечето протеини в пробата, след което да го използват както е. Тази техника обаче е много мръсна, тъй като повечето замърсители все още присъстват, така че е подходяща само ако скоростта е приоритет и чистотата не е проблем. Друг бърз и мръсен подход е премахването на протеини чрез увеличаване на концентрацията на сол чрез добавяне на соли като амоний или калиев ацетат, за да принуди протеините да се утаят. Тази техника също е доста мръсна, тъй като много други замърсители все още присъстват.

Друг подход е да се лизират клетките с детергент, след което разтворът се смесва с изоамилов алкохол, хлороформ и фенол. След това разтворът се разделя на два слоя. Протеините попадат в горния органичен слой, докато ДНК остава в долния воден слой. Тази техника изисква внимателен контрол на концентрацията на солта и рН за добри резултати. Отнема време и фенолът и хлороформът са силно токсични химикали. Следователно, докато фенол-хлороформните екстракции някога са били рутинни, през последните години други техники стават по-популярни.

Анионообменната хроматография предлага по-висока чистота и по-последователни резултати от екстракцията с фенол-хлороформ. Една тръба или колона са пълни с малки частици, които имат положително заредени места върху тях, където може да се свърже отрицателно заредена молекула или анион. ДНК се свързва с тези анионообменни места, докато други замърсители като протеини и РНК се отмиват от колоната. По-късно се използва богат на сол разтвор за изтегляне на ДНК от колоната.

Най-бързата и може би най-надеждна техника за пречистване на ДНК е използването на специално произведен комплект. Тези комплекти съдържат мембрани от силикагел в епруветка. ДНК се придържа към мембраната, докато други замърсители се отмиват с помощта на серия от специално приготвени солеви разтвори, които се доставят с комплекта. Накрая ДНК се измива от колоната с разтвор с ниско съдържание на сол. Тези комплекти са бързи, лесни за използване и предлагат възпроизводими резултати.

След като ДНК бъде изолирана и ресуспендирана в рН контролиран буферен разтвор, последната стъпка е да се тества нейната чистота. Лесен и удобен начин за това е чрез проверка на това колко ултравиолетова светлина поглъща при дължините на вълните 260 и 280 нанометра. Абсорбцията при 260 нанометра, разделена на абсорбцията при 280 нанометра, трябва да е равна на 1,8, ако ДНК е чиста. Измерването на абсорбцията при 260 нанометра също ви позволява да определите концентрацията на ДНК.