ما هي الخطوة الأولى في تفاعل البلمرة المتسلسل؟

تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو PCR ، هو تقنية تقوم بتصوير جزء واحد من الحمض النووي إلى العديد من الأجزاء - العديد منها أضعافا مضاعفة. تتمثل الخطوة الأولى في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في تسخين الحمض النووي بحيث يفسد أو يذوب في خيوط مفردة. إن بنية الحمض النووي تشبه سلم الحبل حيث تكون الدرجات عبارة عن حبال ذات نهايات مغناطيسية. تتصل المغناطيسات لتشكل الدرجات ، تسمى أزواج القاعدة ، وبالتالي تقاوم التمزق. يذوب كل جزء من الحمض النووي في خيوط مفردة عند درجات حرارة مختلفة. إن فهم كيفية ترابط بنية الحمض النووي معًا بواسطة الأجزاء الفردية للحمض النووي سيعطي نظرة ثاقبة عن السبب تذوب شظايا مختلفة من الحمض النووي في درجات حرارة مختلفة ولماذا تكون درجات الحرارة المرتفعة هذه مطلوبة في البداية مكان.

تتمثل الخطوة الأولى في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في إذابة الحمض النووي بحيث ينفصل الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى DNA أحادي الجديلة. بالنسبة للحمض النووي للثدييات ، تتضمن هذه الخطوة الأولى عادةً حرارة تبلغ حوالي 95 درجة مئوية (حوالي 200 فهرنهايت). عند درجة الحرارة هذه ، تتفكك الروابط الهيدروجينية بين أزواج القاعدة A-T و G-C ، أو الدرجات في سلم الحمض النووي ، مما يؤدي إلى فك ضغط الحمض النووي المزدوج الشريطة. ومع ذلك ، فإن درجة الحرارة ليست ساخنة بدرجة كافية لكسر العمود الفقري للفوسفات والسكر الذي يشكل الخيوط المفردة ، أو أقطاب السلم. الفصل الكامل للخيوط المفردة يعدهم للخطوة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهي التبريد للسماح لشظايا الحمض النووي القصيرة ، التي تسمى البادئات ، بربط الخيوط المفردة.

أحد أسباب تسخين الحمض النووي إلى درجة حرارة عالية تبلغ 95 درجة مئوية هو أنه كلما زاد طول حبلا الحمض النووي المزدوج ، زاد رغبته في البقاء معًا. طول الحمض النووي هو أحد العوامل التي تؤثر على نقطة الانصهار المختارة لـ PCR على تلك القطعة من الحمض النووي. أزواج قاعدة A-T و G-C في رابطة الحمض النووي مزدوجة السلسلة مع بعضها البعض لتثبيت بنية الخيط المزدوج معًا. كلما ارتبطت أزواج القاعدة المتتالية بين خيطين منفردين ، كلما أراد جيرانهم أيضًا الترابط ، وزادت قوة الجذب بين الخيطين. إنه مثل سحاب مصنوع من مغناطيس صغير. عندما تغلق السحاب ، فإن المغناطيس يريد بطبيعة الحال أن ينغلق ويظل مضغوطًا.

هناك عامل آخر يؤثر على درجة حرارة الانصهار التي تختارها لجزء الحمض النووي الذي يهمك وهو كمية أزواج قاعدة G-C الموجودة في هذا الجزء. كل زوج أساسي يشبه مغناطيسين صغيرين يجذبان. ينجذب الزوج المصنوع من G و C بقوة أكبر بكثير من الزوجين A و T. وبالتالي ، فإن قطعة الحمض النووي التي تحتوي على أزواج من G-C أكثر من جزء آخر تتطلب درجة حرارة أعلى قبل أن تذوب في خيوط مفردة. يمتص الحمض النووي بشكل طبيعي الضوء فوق البنفسجي - بطول موجة يبلغ 260 نانومتر ، على وجه الدقة - ويمتص الحمض النووي أحادي السلسلة ضوءًا أكثر من الحمض النووي مزدوج الشريطة. لذا فإن قياس كمية الضوء الممتص هو طريقة لقياس مدى انصهار الحمض النووي مزدوج الشريطة في خيوط مفردة. تأثير "السوستة المغناطيسية" لأزواج قاعدة G-C و A-T هو ما يتسبب في رسم بياني لامتصاص الضوء تم رسم الحمض النووي مزدوج الشريطة مقابل زيادة درجة الحرارة ليكون سينيًا ، على شكل حرف S وليس خط مستقيم. يمثل منحنى S مقاومة العمل الجماعي التي تمارسها أزواج القاعدة ضد الحرارة لأنهم لا يريدون الانفصال.

تسمى درجة الحرارة التي يذوب عندها طول الحمض النووي في خيوط مفردة درجة حرارة الانصهار ، والتي يُرمز إليها بالاختصار "Tm". يشير هذا إلى درجة الحرارة التي يذوب عندها نصف الحمض النووي في المحلول إلى خيوط مفردة والنصف الآخر لا يزال في خيط مزدوج شكل. تختلف درجة حرارة الانصهار لكل جزء من الحمض النووي. يحتوي الحمض النووي للثدييات على محتوى G-C بنسبة 40 ٪ ، مما يعني أن 60 ٪ المتبقية من أزواج القاعدة هي As و Ts. يؤدي محتواه البالغ 40٪ من G-C إلى ذوبان الحمض النووي للثدييات عند 87 درجة مئوية (حوالي 189 فهرنهايت). هذا هو السبب في أن الخطوة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي للثدييات هي تسخينه إلى 94 درجة مئوية (201 فهرنهايت). فقط سبع درجات أكثر سخونة من درجة حرارة الانصهار وستذوب جميع الخيوط المزدوجة تمامًا إلى خيوط مفردة.